Giardia Duodenum ass e parasitären Organismus deen Giardiasis verursaacht, eng Darm Infektioun besonnesch heefeg bei jonke Kanner mat klineschen Zeeche vun Diarrho.Mir hu virdru gemellt datt extrazellulär G. duodenalis d'Aktivatioun vum intrazelluläre Oligomeriséierung-ähnlechen Rezeptor 3 (NLRP3) bindend Nukleotiden ausléist a reguléiert Hostentzündungsreaktiounen duerch extrazellulär Vesikel (EV) Sekretioun.Wéi och ëmmer, déi exakt molekulare Mustere vum Pathogen-assoziéierten Duodenokokken EV (GEV), déi an dësem Prozess involvéiert sinn an d'Roll vum NLRP3-Inflammasom bei Giardiasis bleiwen opgekläert.
Rekombinant eukaryoteschen Ausdrock Plasmiden pcDNA3.1 (+) -alpha-2 an Alpha-7.3 Giardins zu GEV goufen gebaut, transfected an Mais primär peritoneal macrophages, an entdeckt duerch Miessunge der inflammation Zil- Molekül caspase-1.D'p20 Ausdrock Niveau war opgefouert..G. duodenalis Alpha-2 an Alpha-7.3 Giardines goufen ursprénglech duerch Miessung NLRP3 inflammasome identifizéiert (NLRP3, pro-interleukin-1 Beta [IL-1β], pro-caspase-1 an caspase-1 p20), IL secretion.1β Niveauen, apoptotesch Fleckprotein (ASC) Oligomeriséierungsniveauen, an immunofluoreszent Lokaliséierung vun NLRP3 an ASC.D'Roll vun der NLRP3 inflammasome an der pathogenicity vun G. duodenalis war dann mat Mais beurteelt an deenen NLRP3 Aktivatioun blockéiert war (NLRP3 blockéiert Mais) a pathologesch Verännerungen am Kierpergewiicht, duodenal parasitesch Belaaschtung, an duodenal Otemschwieregkeeten goufen iwwerwaacht.Zousätzlech hu mir ënnersicht ob hiardines alpha-2 an alpha-7.3 IL-1β-Sekretioun in vivo iwwer den NLRP3-Inflammasom induzéieren an d'Roll vun dëse Molekülen an der Pathogenizitéit vu G. duodenalis bei Mais bestëmmen.
Alpha-2 an Alpha-7.3 Giardines induzéieren d'Aktivatioun vum NLRP3 Inflammasom in vitro.Dëst huet zu der Aktivatioun vu p20 Caspase-1 gefouert, eng Erhéijung vun den Ausdrockniveauen vun NLRP3, pro-IL-1β, a pro-caspase-1 Proteinen, eng bedeitend Erhéijung vun der IL-1β Sekretioun, d'Bildung vun ASA Flecken an der Zytoplasma, an d'Induktioun vun der ASA Oligomeriséierung.NLRP3 Entzündung Penile Verloscht verschäerft d'Pathogenizitéit vu G. duodenalis bei Mais.Mais, déi mat Zysten duerch Gavage vun NLRP3-blockéierte Mais behandelt goufen, weisen eng erhéicht Zuel vun Trophozoiten a schwéiere Schued un den Duodenal Villi, charakteriséiert duerch necrotesch Krypta mat geschrumpften a Verzweigung.In vivo Experimenter hu gewisen datt Giardinen alpha-2 an Alpha-7.3 d'Sekretioun vun IL-1β iwwer den NLRP3-Inflammasom induzéieren kënnen, an d'Immuniséierung mat Giardinen alpha-2 an Alpha-7.3 reduzéiert d'Pathogenizitéit vu G. duodenalis bei Mais.
Zesummegefaasst suggeréieren d'Resultater vun dëser Etude datt Giardia alpha-2 an Alpha-7.3 d'Upregulatioun vun der Host NLRP3 Entzündung verursaachen an d'Infektivitéit vu G. duodenalis bei Mais reduzéieren, déi villverspriechend Ziler sinn fir Giardiasis ze vermeiden.
Giardia Duodenum ass en extrazelluläre protozoan Parasit deen am Dënndarm lieft an all Joer 280 Millioune Fäll vu Giardiasis mat Diarrho verursaacht, besonnesch bei jonke Kanner an Entwécklungslänner [1].D'Leit ginn infizéiert duerch Drénkwaasser oder Liewensmëttel kontaminéiert mat M. Duodenum-Zysten, déi dann an de Mo erakommen an an de Magensaft ausgeschloss ginn.Giardia Duodenum Trophozoiten befestigen sech un den Duodenal Epithel, verursaache Iwwelzegkeet, Erbrechung, Diarrho, Bauchschmerzen a Gewiichtsverloscht.Leit mat Immundefizit a zystesch Fibrose sinn ufälleg fir Infektioun.Infektioun kann och duerch mëndlech an analsex geschéien [2].Medikamenter wéi Metronidazol, Tinidazol, an Nitazoxanid sinn déi bevorzugt Behandlungsoptioune fir Duodenal Infektiounen [3].Allerdéngs verursaache dës Chemotherapie Medikamenter negativ Nebenwirkungen wéi Iwwelzegkeet, Karzinogenesis a Genotoxicitéit [4].Dofir musse méi effektiv Strategien entwéckelt ginn fir G. duodenalis Infektioun ze verhënneren.
Inflammasomen sinn eng Klass vun zytosolesche Proteinkomplexen, déi Deel vun der gebierter Immunantwort sinn, hëllefe géint Pathogeninvasioun ze verteidegen an entzündlech Äntwerten ze vermëttelen [5].Ënnert dësen Inflammasomen ass Nukleotidbindend Oligomeriséierung (NOD) Rezeptor 3 (NLRP3) Nukleotidbindend Oligomeriséierung (NLRP3) Nukleotidbindendähnlech Inflammasom extensiv studéiert ginn, well et duerch verschidde Pathogen / Schued-assoziéiert molekulare Mustere (PAMP /) erkannt ka ginn. DAMP), erkennt, aktivéiert den gebuerene Immunsystem.a reguléiert intestinal Homeostasis a ville entzündleche Krankheeten [6,7,8].Et besteet aus dem Mustererkennungsrezeptor (PRR) NLRP3, engem Adapter apoptotesch Fleckprotein (ASC), an en Effektor Procaspase-1 oder Procaspase-11.D'NLRP3 inflammasome Akten als Provider géint pathogen Invasioun, wéi zu Neospora caninum observéiert [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], an Leishmania Studien.[11], mä et ass och gemellt ginn, datt d'Aktivatioun vun der NLRP3 inflammasome Schutzmoossnamen immun Äntwerte limitéieren an Krankheet Werdegang exacerbates, zum Beispill, an Wierm [12].Baséierend op eise fréiere Conclusiounen, hu mir gemellt datt extrazellulär G. duodenalis intrazellulär Aktivatioun vun NLRP3-Entzündung ausléist a Host-entzündlech Äntwerte moduléiert andeems extrazellulär Vesikel (EVs) secretéiert gëtt [13].Allerdéngs bleift d'Roll vun der NLRP3 inflammasome zu G. duodenalis Infektioun in vivo ze bestëmmen.
Giardins goufen ursprénglech als strukturell Komponente vum G. duodenalis Zytoskelett beschriwwen a spillen eng wichteg Roll bei der Trophozoit-Motilitéit an der Epithelzellanhängung am Dënndarm.Fir besser un d'Ëmwelt upassen an hir pathogenicity Erhéijung, G. duodenalis trophozoites entwéckelt eng eenzegaarteg cytoskeletal Struktur besteet aus 8 flagella, 1 Mëtt Kierper, an 1 ventral disc [14].D'Trophozoiten vum Giardia Duodenum benotzen hiren Zytoskelett fir den ieweschten Dënndarm, besonnesch den Duodenum, anzegräifen an un d'Enterocyten ze befestigen.Si migréieren stänneg a befestigen sech un Epithelzellen mam Zellmetabolismus.Dofir gëtt et eng enk Relatioun tëscht hirem Zytoskelett a Virulenz.Giardines spezifesch fir Giardia Duodenum sinn Komponente vun der Zytoskelett Struktur [15] a sinn a véier Klassen ënnerdeelt: α-, β-, γ-, an δ-Giardines.Et ginn 21 Membere vun der α-Giardin Famill, déi all eng Kalzium-ofhängeg Fähegkeet hunn Phospholipiden ze binden [16].Si verbannen och den Zytoskelett mat der Zellmembran.An Individuen mat Diarrho verursaacht duerch G. duodenalis, α-Giardins sinn héich ausgedréckt an immunoreaktiv wärend der Infektioun [17].Heterolog Impfungen baséiert op Giardia alfa-1 geschützt géint Giardiasis bei Mais a si potenziell Kandidatantigenen fir Impfungentwécklung [18].Alpha-8 Giardin, lokaliséiert an der Plasma Membran a Flagella, awer net an der ventral disc, verbessert d'Motilitéit a Wuesstem Taux vun trophozoites an G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin befestegt op microtubule Strukturen op flagella an beaflosst d'Viabilitéit vun G. duodenalis [20].Alpha-11 Giardine ass am Iwwerfloss am ganze Liewenszyklus präsent, an Iwwerexpressioun vun Alpha-11 Giardine beschiedegt G. duodenalis selwer [21].Wéi och ëmmer, et ass onkloer ob Alpha-2 Giardine an Alpha-7.3 Giardine Schutz géint G. duodenalis Infektioun an hir Basisdaten Mechanismen sinn.
An dëser Etude, rekombinant eukaryoteschen Ausdrock plasmids pcDNA3.1 (+)-alpha-2 Giardine an pcDNA3.1 (+)-alpha-7.3 Giardine goufen an Mais primär peritoneal macrophages transfected Host NLRP3 ze aktivéieren.Inflammasome Ziler goufen duerno gepréift.Mir bewäerten och d'Roll vun der NLRP3 inflammasome an der pathogenicity vun G. duodenalis, ënnersicht ob Alpha-2 an Alpha-7,3 giardines Aktivatioun vun der NLRP3 inflammasome in vivo induce, a festgestallt, datt dës zwou Rollen vun giardines an der pathogenicity vun G. duodenalis.Eist gemeinsamt Zil war villverspriechend Ziler fir d'Préventioun vu G. duodenalis Infektioun z'entwéckelen.
Wëllt Typ (WT) C57BL /6 weiblech Mais am Alter vu 5-8 Wochen goufen vum Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, China) kaaft.D'Mais haten gratis Zougang zu Waasser, kruten steriliséiertem Iessen a goufen an engem 12/12 Stonn Liicht/Däischter Zyklus gehal.Virun der Infektioun kruten d'Mais Antibiotike ad libitum am Drénkwaasser ergänzt mat Ampicillin (1 mg / ml), Vancomycin (1 mg / ml) an Neomycin (1,4 mg / ml) (all kaaft vu Shanghai, China, kënschtlech Organismen) [22 ].].Mais, déi d'Fäegkeet verluer hunn ze iessen an ze drénken fir > 24 Stonnen an ≥ 20% Kierpergewiicht verluer hunn, goufen mënschlech duerch Gebärmutterhëllef euthaniséiert.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) goufen ergänzt mat 12,5% Fetal Bovine Serum (FBS; Every Green, Zhejiang, China) an 0,1% Bovine Bile (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ).USA) ënner mikroaerobe Bedéngungen.Konfluent Trophozoiten goufen op Äis gesammelt a passéiert an engem Verhältnis vun 1:4 fir weider Reproduktioun.
Giardia ausléisen cysts sech entschlof wéi virdru beschriwwen [23], trophozoites sech an logarithmic Phase recoltéiert an dann mat encapsulation induce mëttelfristeg verdënntem, pH 7.1 (geännert TYI-S-33) zu enger Finale Konzentratioun vun 1 × 106 trophozoites /ml.Gallekonzentratioun 0,05% mëttel).Trophozoite goufen ënner anaerobe Bedéngungen bei 37 ° C bis zur logarithmescher Wuesstumsphase kultivéiert.Änneren de mëttelfristeg zu cyst inducing mëttelfristeg (pH 7,8; ​​geännert TYI-S-33 mëttelfristeg mat 1% Bile Konzentratioun) a Kultur G. duodenalis bei 37 ° C fir 48-96 Stonnen, während deenen d'Formatioun cysts ënnert engem microscope observéiert goufen.Nodeems déi meescht vun den Trophozoiten induzéiert waren fir Zysten ze bilden, gouf d'Kulturmëschung gesammelt an an sterilt deioniséiertem Waasser resuspendéiert fir déi verbleiwen Trophozoiten ze lyséieren.Cysts goufen gezielt a bei 4 ° C fir spéider Analysen duerch eng gastric Rouer an Mais gespäichert.
Giardia extracellular vesicles (GEVs) sech beräichert wéi virdru beschriwwen [13].Trophozoites an der logarithmescher Wuesstumsphase goufen am modifizéierten TYI-S-33 Medium resuspendéiert mat exosome-entschäerften FBS (Biologesch Industrien, Beit-Haemek, Israel) op eng final Konzentratioun vun 1 × 106 Parasiten /ml a fir 12 Stonnen inkubéiert.goufen aus der Kultursupernatant duerch Zentrifugéierung bei 2000 g fir 10 min, 10.000 g fir 45 min, an 100.000 g fir 60 min isoléiert.Nidderschlag goufen an phosphate gebufferten Salins (PBS) opgeléist, quantifizéiert mat engem BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a bei -80 ° C gespäichert oder direkt fir weider Analysen benotzt.
Primärschoul Maus peritoneal macrophages sech virbereet wéi virdru beschriwwen [24].Kuerz gesot, Mais (am Alter vu 6-8 Wochen) goufen (intraperitoneal [ip]) mat 2,5 ml vun 2,98% Difco flësseg Thioglycol Medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) injizéiert an 3-4 Gaass gefiddert.Eng Suspension vu Makrophagen gouf aus der Bauchhöhle vu Mais no Euthanasie gesammelt an 3 Mol bei 1000 g fir 10 min centrifugéiert.Recolte Zellen sech duerch Flux cytometry benotzt der CD11b Marker entdeckt bis Zell Rengheet war> 98%, dann zu 6-gutt Zell Kultur Placke (4,5 x 106 Zellen /gutt) dobäi a mat 10% FBS (Bioindustrie) bei 37 ° C incubated.an 5% CO2.
RNS war aus 1 × 107 trophozoites an 1 ml vun TRIzol reagent (Vazyme, Nanjing, China) ofgebaut, genomic DNA war aus total G. duodenalis RNS ofgebaut MonScript dsDNase benotzt (Monad, Wuhan, China) an komplementar DNA (cDNA) war synthetiséiert. benotzt MonScript RTIIII Super Mix (Monad) no den Instruktioune vum Hiersteller.
CDS Haaptrei Informatiounen fir d'Zil G. duodenalis Gentherapie war vun der NCBI GenBank kritt.Benotzt Primer 5.0 fir spezifesch nahtlos Klonenprimer fir all Zilgen ze designen.De Forward Primer (5'-3') besteet aus dräi Deeler: eng iwwerlappend Sequenz mat engem lineariséierte Vektor pcDNA3.1 (+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) a Startkodonen ATG an GNN (wann déi éischt Basis net G ass).Dëst gëtt gemaach fir d'Effizienz vum Ausdrock ze verbesseren.Zousätzlech, op d'mannst 16 BP kombinéiert Basen (GC Inhalt 40-60% / Tm ca. 55 ° C).De Réckprimer (5'-3') besteet aus zwee Deeler, eng iwwerlappend Sequenz mat engem EcoRV-lineariséierte Vektor pcDNA3.1 (+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) an enger kombinéierter Basis vu mindestens 16 BP.(ausser déi lescht zwee Arrêten).Basen) e Codon wéi AA oder GA fir rekombinant Plasmiden z'erméiglechen hir markéiert Proteinen auszedrécken).D'Primer Sequenzen sinn an Table 1 opgezielt a goufen duerch Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China) synthetiséiert.
Ziler goufen amplifizéiert mat Pfu DNA Polymerase (Tiangen, Peking, China) oder Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, China) mat preparéierten G. duodenalis cDNA als Schabloun.D'eukaryotic Ausdrock Vecteure Plasmid pcDNA3.1 (+) war linearized mat Restriktioun Enzym EcoRV an dephosphorylated benotzt Fast AP (Thermo Fisher Wëssenschaftlech).Lineariséiert pcDNA3.1 (+) Fragmenter an amplifizéiert Zil- Genfragmenter goufen mat engem DNA Gel Offäll Kit (Tiangen) gereinegt a quantifizéiert mat engem Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).D'pcDNA3.1(+) Fragment an all Zil-Gen-Fragment goufen rekombinéiert mat MonClone Single Assemblée Klonenmix (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) a bestätegt duerch DNA Sequenzéierung mat Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Endotoxin-gratis Plasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 an pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 goufen mat der SanPrep Endotoxin-gratis Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) generéiert.D'Konzentratioun gouf iwwer 500 ng /μl erhale fir sécherzestellen datt d'EDTA am Elutiounsbuffer net mat der Transfektionsassay stéiert.Primär-Maus peritoneal macrophages sech cultured zu 6-gutt Placke mat komplett RPMI 1640 mëttelfristeg (biologesch Industrien) fir 12 Stonnen, dann goufen d'Zellen 3 Mol an waarm PBS gewäsch Penicillin an streptomycin ze läschen, an dann an mëttelfristeg mat komplett mëttelfristeg ergänzt.Endotoxin-gratis Plasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 an pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) goufen an 125 μl Opti-MEM reduzéiert Serummedium (Gibco, Thermo Fisher Scientific) verdünnt..Dann 5 μl Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Wëssenschaftlech) war an 125 μl vun niddereg serum Opti-MEM mëttelfristeg verdënntem.Bereet Liposomen-DNA-Komplexe andeems Dir dat verdënntem Endotoxin-fräie Plasmid mat Lipofectamine 2000 vermëscht an d'Mëschung erlaabt fir 5 Minutten bei Raumtemperatur ze stoen.Transfert d'Komplexe getrennt an d'Zellen an all Brunn a mëscht lues.No 4 Stonnen, war d'Zell Kultur mëttelfristeg ersat mat 2 ml vun komplett RPMI 1640 mëttelfristeg an Kultur war fir 24 Stonnen weider.Frësch Zellkulturmedium gouf an d'Zellen bäigefüügt a fir verschidden Zäitpunkte inkubéiert ofhängeg vum Assay Design.
Protein Echantillon vun supernatants an Zell lysates sech virbereet wéi virdru beschriwwen [25].Membran Transfermaart Parameteren fir pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, an His-Tag waren 200 mA /90 min.Fir Interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Schwäiz) an NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Schwäiz) an 1:5000 gezielt Seng Tag (Amylet Scientific, Wuhan, China) a β-Actin (Proteintech, Wuhan, China).
Cross-verbindung mat disuccinimide suberate (DSS) war gesuergt wéi virdru beschriwwen [26].Zellen goufen 3 Mol mat kale PBS gewäsch a komplett mat enger 27 Jauge Nadel an 50 μl ASC Reaktiounsbuffer (pH 8.0) mat 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES an 125 mM NaHCO3 geläscht.D'Mëschung gouf bei 5000 g fir 3 min centrifugéiert an de Pellet gouf mat 10 µl DSS (25 mM an DMSO) an 40 µl ASC Reaktiounsbuffer fir 30 min bei 37 ° C gesaat.No der Zentrifugatioun bei 5000 g fir 10 min, gouf de Pellet an enger Léisung vun 40 μl ASC Reaktiounsbuffer an 10 μl 6x Protein Luedebuffer (TransGen, Peking, China) opgeléist, an dann ass d'Léisung bei Raumtemperatur fir 15 geläscht. min., Da kachen 10 Minutten.Protein Echantillon goufen dann zu Western blotting mat Primärschoul Anti-ASC antibodies (Wanleibio, Shenyang, China) bei engem Verdünnung Verhältnis vun 1:500 ënnerworf.
No enger virdru beschriwwen Prozedur [13], goufen Zell Kultur supernatants recoltéiert an secretion vun der pro-demagogesch cytokine IL-1β war mat der Maus IL-1 Beta ELISA Kit (Invitrogen, Thermo Fisher Wëssenschaftlech) bestëmmt.Konvertéiert OD450nm Wäerter a Proteinkonzentratioune mat der IL-1β Standardkurve.
Zellen, déi op Coverslips beschichtet goufen, goufen sanft 3 Mol a waarme PBS gewäsch, an Tissuezellfixativ fixéiert (Biosharp, Peking, China) fir 10 min bei Raumtemperatur (RT), an 0,1% Triton X-Permeabilize bei 100 (verdünnt a PBS; Biosharp) ) fir 20 Minutten bei Raumtemperatur a blockéiert an 5% Bovine Serum Albumin (am PBS) fir 2 Stonnen bei Raumtemperatur.Zellen goufen dann iwwer Nuecht bei 4 ° C mat primären Antikörper géint ASC (1:100 Verdünnung) oder NLRP3 (1:100 Verdünnung) inkubéiert, respektiv, a Cy3 markéiert Geess Anti-Kanéngchen IgG (H + L) (1:400; EarthOx) , San Francisco, CA, USA) oder FITC-konjugéiert Geess Anti-Maus IgG (1:400; Earthox) Iwwernuechtung bei 37 ° C am Däischteren fir 1 Stonn.D'Käre sech mat Hoechst 33258 (10 μg /ml; UE, Suzhou, China) fir 5 Minutten Kierchefënster an ënner engem fluorescence microscope observéiert (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Mais goufen a véier Gruppen opgedeelt (n = 7 an all Grupp): (i) PBS-behandelt negativ Kontrollgruppe (nëmmen PBS; Gavage 100 μl /Maus PBS gefollegt vun alldeeglechen intraperitonealer Injektioun 100 μl /Maus PBS 3 Stonnen méi spéit)., kontinuéierlech fir 7 Deeg);(ii) negativ Kontroll Grupp behandelt mat MCC950 inhibitor [27] (100 μl /Maus via PBS gavage, 3 Stonnen méi spéit, 10 mg /kg Kierpergewiicht [BW] MCC950 [an PBS] war intraperitoneally deeglech verwalt, Dauer 7 Deeg);(iii) G. duodenalis cyst Infektioun Grupp (1,5 x 106 cysts /Maus vun gavage, 3 Stonnen méi spéit, 100 μl /Maus PBS intraperitoneally all Dag fir 7 Deeg verwalt);(iv) G. duodenalis cyst kombinéiert Wonn Grupp MCC950 inhibitor Behandlung Grupp (1,5 × 106 cysts /Maus via gavage, 10mg /kg Kierpergewiicht MCC950 intraperitoneally deeglech fir 7 Deeg um 3h).De Kierpergewiicht vun all Maus gouf all Dag iwwerwaacht an all Mais goufen um 7. Dag euthaniséiert.Recolte Duodenum (3 cm laang) war an kleng Stécker an 1 ml PBS geschnidde, cysts goufen Iwwernuechtung an PBS bei 4 ° C zerstéiert, an G. duodenalis trophozoites.Frësch Ausléiser (1 cm laang) war fir hematoxylin an eosin (H & E) staining isoléiert.
Mais goufen an zwou Gruppen opgedeelt: (i) MOCK Kontrollgruppe an (ii) MCC950 Inhibitor Grupp.Et waren fënnef Behandlungen an all Grupp (n = 7 / Behandlungsgrupp): (i) PBS Behandlung negativ Kontrollgruppe (nëmmen PBS; 100 μl / Maus PBS, intramuskulär (IM) Injektioun (tibialis anterior) [28, 29]; ( ii) pcDNA3.1 (+) Plasmid negativ Kontroll Grupp (100 µg / Maus DNA, via intramuscular Sprëtz) G. duodenalis cyst Infektioun positiv Kontroll Grupp (1,5 x 106 cysts / Maus, via sonden) (iv) a); Grupp behandelt mat Plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg / Maus-DNA, duerch intramuskulär Injektioun), an (v) eng Grupp behandelt mat Plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg / Maus) DNA, no 12 Stonnen Passage, Mais an der MCC950 inhibitor Grupp krut eng deeglech intraperitoneal Injektioun vun MCC950 (10 mg /kg Kierper Gewiicht) fir 7 Deeg, iwwerdeems Mais an der MOCK Grupp e gläiche Volume vun PBS Behandlung krut. gesammelt aus de eyeballs Mais an iwwer Nuecht bei 4 ° C Serum Echantillon waren isoléiert mat Enzym-verbonne immunosorbent assay (ELISA) fir a Miessunge vun IL-1β Niveauen.
Drësseg-fënnef Mais goufen a fënnef Gruppen opgedeelt (n = 7 / Grupp).Grupp 1 war eng negativ Kontrollgruppe mat PBS behandelt: Mais kruten 100 μl PBS intramuskulär an 3 Deeg méi spéit duerch Gavage.Grupp 2 ass eng positiv Kontroll Grupp mat G. duodenalis cysts infizéiert: Mais goufen mat 100 μl vun PBS injizéiert, an 3 Deeg méi spéit 1,5 x 106 cysts /Maus goufen intragastric injizéiert.Drëtt Grupp - Plasmidimmuniséierung mat pcDNA3.1 (+) a Kombinatioun mat enger Kontrollgruppe fir Duodenal Cyst Infektioun: Mais kruten 100 μg Plasmid DNA pcDNA3.1 (+) (im) mëndlech, 1,5 × 106 Zysten / Maus 3 fir e puer Deeg.Gruppen 4 a 5 waren rekombinant pcDNA3.1 (+)-alpha-2 giardine plasmid oder pcDNA3.1 (+)-alpha-7.3 giardine plasmid a Kombinatioun mat G. duodenalis cyst Wonn.Experimentell Grupp: Mais kruten 100 µg pcDNA3.1 (+) -Giardine Plasmid DNA (im), dann 3 Deeg méi spéit, 1,5 × 106 cysts /Maus sech via gavage injizéiert.D'Kierpergewiicht vun all Maus gouf no der Aféierung vun der G. duodenalis Cyst duerch d'Röhre iwwerwaacht.Frësch Ausléiser gouf fir parasitic Laascht Miessunge an HE staining Analyse gesammelt.
Histopathological Ännerungen sech no engem virdrun publizéiert Prozedur analyséiert [30].Frësch Duodenum gouf mat Otemschwieregkeeten Zell fixative fixéiert, am paraffin agebonne, an 4 μm Rubriken geschnidden, mat H&E gefierft an ënner engem Liichtmikroskop analyséiert.Representativ pathologesch Verännerungen a siwe Tissue Sektioune vu siwen onofhängege Mais goufen vun engem Pathologe bewäert, deen d'Behandlung net bewosst ass, a goufe bei 200x Vergréisserung ageholl.D'Längt vun de Villi an d'Tiefe vun de Krypta goufen am Aklang mat de virdru beschriwwene Methoden gemooss.
D'Resultater in vitro an in vivo goufen an triplicate kritt.Grafike goufen generéiert mat GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).D'Ënnerscheeder tëscht zwou Gruppen goufen duerch t-Test analyséiert, während Differenzen tëscht ≥3 Gruppen duerch een-Manéier Varianzanalyse (ANOVA) mat SPSS Software (Versioun 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) analyséiert goufen.Date goufen fir Homogenitéit vun Varianz analyséiert Levene d'Test gefollegt vun Bonferroni d'Post hoc Test (B).D'Bedeitung gëtt ausgedréckt als P<0,05, P<0,01, a P<0,001 (net bedeitend [ns]) (P>0,05).
Eis fréier Analyse vu GEV-Proteomics an der Kyoto Enzyklopedie vu Genen a Genome (KEGG) huet gewisen datt vill Ziler an der Aktivatioun vun entzündleche Signalweeër involvéiert kënne sinn [13].Mir hunn zwee villverspriechend Ziler ausgewielt, Alpha-2 an Alpha-7.3 Giardins, verstäerkt dës Moleküle a benotze se fir den pcDNA3.1 (+) eukaryoteschen Ausdrockvektor ze konstruéieren.No Sequencing, rekombinant pcDNA3.1 (+) -alpha-2 an Alpha-7.3 Giardine Ausdrock plasmids sech an primär Maus peritoneal macrophages transfected, an der caspase-1 p20 Ënnerschrëft Protein vun inflammation (e Fragment vun ageschalt caspase-1) gouf identifizéiert. als Erklärung vun Schlësselmoleküle déi d'Entzündung ausléise kënnen.D'Resultater weisen, datt Alpha-2 an Alpha-7.3 Giardines p20 caspase-1 Ausdrock ähnlech ze GEV induce kann.Keen Effekt op caspase-1 Aktivatioun war an der onbehandelt negativ Kontroll (PBS nëmmen) a plasmid Kontroll pcDNA3.1 (+) (Dorënner 1) fonnt.
Miessung vun p20 caspase-1 Aktivatioun vun pcDNA3.1 (+) -alpha-2 an alpha-7.3 giardins.Rekombinant eukaryoteschen Ausdrock plasmids pcDNA3.1 (+) -alpha-2 an Alpha-7.3 Giardines (iwwer all Spur) goufen an primär Maus peritoneal macrophages transfected a Kultur supernatants sech 24 Stonnen méi spéit gesammelt.Western blotting war benotzt Ausdrock Niveau vun der Ënnerschrëft caspase-1 p20 inflammasome Protein ze moossen.D'PBS-nëmmen Behandlung Grupp (Lane C) an der pcDNA3.1 (+) monotherapy Grupp (pcDNA3.1 Lane) sech als negativ Kontroll benotzt, an der GEV Behandlung Grupp war als positiv Kontroll benotzt.Ausdrock vun der recombinant Protein war vun engem histidin Tag an all Protein z'entdecken bestätegt, an der erwaart Protein Bands sech Alpha-2 giardine (38,2 kDa) an Alpha-7,3 giardine (37,2 kDa).GEV, Giardia duodenum extracellular vesicles, pcDNA3.1(+), EcoRV-lineariséierte Vektor, SUP, Supernatant
Fir ze bestëmmen ob Alpha-2 Giardine an Alpha-7.3 Giardine p20 Caspase-1 Ausdrock induzéieren an eng Roll bei der Aktivéierung vum Host NLRP3 entzündleche Reaktioun spillen, pcDNA3.1(+)-alpha-2 Giardine a pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin war an der Primärschoul Maus peritoneal macrophages mat recombinant plasmid DNA transfected, an Niveau vun Ausdrock, Lokalisatioun, an oligomerization vun de Schlëssel demagogesch Proteinen NLRP3 sech bestëmmt.An dësem Experiment war GEV als positiv Kontroll Grupp benotzt, an der keng Behandlung Grupp (PBS nëmmen) oder der pcDNA3.1 (+) transfection Behandlung Grupp war déi negativ Grupp.D'Resultater weisen datt, wéi an der GEV Grupp, rekombinant Plasmid DNA vu giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 a giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 zu Upreguléierung vun NLRP3, pro-IL-1β an procaspase-1 an caspase-1 Aktivatioun (Figebam. 2a).Zousätzlech hunn béid Giardine bedeitend IL-1β Sekretioun induzéiert (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 Giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 Giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Dorënner 2b).Déi meescht ASC Proteine ​​ware monomer an der No-Behandlungsgrupp oder an der Behandlungsgrupp transfektéiert mam pcDNA3.1(+) Plasmid, am Géigesaz zu pcDNA3.1(+)-alpha-2 oder pcDNA3.1(+)-alpha- 7, 3 giard.ASC oligomerization geschitt an der recombinant plasmid DNA vun der GEV positiv Kontroll Grupp oder Grupp, eng oligomeresch Form weist (Dorënner 2c).Dës virleefeg Donnéeën suggeréieren datt Alpha-2 Giardine an Alpha-7,3 Giardine d'NLRP3 Entzündungsaktivéierung induzéieren.Duerno immunofluorescent Studien vun der Lokalisatioun vun ASC an NLRP3 weisen datt an der negativer Kontrollgruppe den ASC Protein am Zytoplasma verspreet war an als Punkt Signal op Stimulatioun vu pcDNA3.1 (+) -alpha-2 mat Giardine oder pcDNA3 erschéngt.1 (+) -alpha-7,3 Giardine Grupp oder GEV positiv Kontroll Grupp (Dorënner 2d).An der negativ Kontroll a plasmid-behandelt pcDNA 3.1 Gruppen, war d'NLRP3 Protein Signal net festgestallt, während e fluorescent Signal Punkt an Äntwert op pcDNA3.1 (+) -alpha-2 Giardine oder pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 entdeckt gouf..Giardine ginn am Zytoplasma fonnt oder bei der Stimulatioun vum HEV (Fig. 2e).Dës Donnéeën weisen weider datt G. duodenalis giardin alpha-2 a giardin alpha-7.3 den NLRP3-Inflammasom an Mais primär peritoneal Makrophagen aktivéieren.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 Giardin a pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 Giardin aktivéieren den NLRP3-Inflammasom bei Maus peritoneal Makrophagen.Transfektéiert déi rekombinant eukaryotesch Ausdrocksplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 Giardin an pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 Giardin an primär murine peritoneal Makrophagen an Zellen, oder sammelt den Supernatant bannent 24 Stonnen fir Analyse vum Ausdrock, Oligomeriséierung , Geheimnis.a Lokaliséierung vu Schlësselentzündungsproteine.D'PBS-nëmmen (C) Grupp an der pcDNA3.1 (+) Single Behandlung Grupp sech als negativ Kontroll benotzt, an der GEV Behandlung Grupp war als positiv Grupp benotzt.e Schlëssel inflammatoresch Proteinen NLRP3, dorënner NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, an p20 caspase-1, goufen duerch Western blotting festgestallt.b D'Niveaue vun der Sekretioun vun IL-1β an de Supernatanten goufen mat Enzym-verbonne Immunosorbent Assay (ELISA) bestëmmt.D'Ënnerscheeder tëscht Kontroll- an experimentellen Gruppen goufen duerch One-Way Varianzanalyse (ANOVA) mat der SPSS Software Versioun 22.0 analyséiert.Asterisken weisen bedeitend Differenzen tëscht Gruppen **P<0,01 an ***P<0,001.c ASC Oligomeriséierungsniveauen a Pellets goufen duerch DSS Cross-linking Analyse festgeluegt, während ASC Niveauen an Zelllysate als Luedekontrolle benotzt goufen.d Visualiséierung vun der ISC Lokaliséierung mat Immunofluoreszenz.e Immunofluorescence war benotzt der Lokalisatioun vun NLRP3 ze visualiséieren.ASC, apoptotesch Speck-ähnlech Protein;IL, interleukin;NLRP3, nukleotid-bindende oligomerization-like receptor 3;ns, net bedeitend (P > 0,05)
Béid G. duodenalis an d'GEVs déi se sekretéiert aktivéieren den NLRP3-Inflammasom a reguléieren Host-inflammatoresch Reaktiounen in vitro.Also bleift d'Roll vum NLRP3-Inflammasom an der Pathogenizitéit vu G. duodenalis onkloer.Fir dëst Thema z'ënnersichen, entworf mir en Experiment tëscht Mais infizéiert mat G. duodenalis Cyst a Mais infizéiert mat G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor Behandlung an Verglach NLRP3 inflammasome Ausdrock wann mat G. duodenalis cyst infizéiert.Eng detailléiert Schema vum Experiment gëtt an der Figur 3a gewisen.Ännerungen am Kierpergewiicht vu Mais a verschiddene Behandlungsgruppen goufen 7 Deeg no der Infektioun mat Zysten iwwerwaacht, an d'Resultater ginn an der Fig. 3b gewisen.Am Verglach mat der Grupp, déi mat purem PBS behandelt gouf, hunn d'Resultater gewisen datt (i) d'Kierpergewiicht vu Mais infizéiert mat G. duodenalis Cyst vum Dag 3 op den Dag 7 no der Infektioun erofgaang ass;(ii) Behandlung mam MCC950 Inhibitor huet kee signifikanten Effekt op d'Kierpergewiicht vun de Mais..Am Verglach mat der eenzeger Infektiounsgrupp ass de BW vun der Duodenal Infektiounsgrupp, déi mat MCC950 behandelt gouf, op ënnerschiddlech Grad erofgaang (Dag 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Dag 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; Dag 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Dag 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175;Dës Donnéeën weisen datt den NLRP3 Inflammasom d'Mais schützt vu wesentleche Gewiichtsverloscht an de fréie Stadien (2-4 Deeg) vun der Duodenal Infektioun.Mir gezielt dann G. duodenalis trophozoites an ausléisen lavage Flëssegket z'entdecken an d'Resultater sinn an Dorënner 3c gewisen.Am Verglach mat der G. duodenalis Cyst Infektiounsgrupp ass d'Zuel vun den Trophozoiten am Duodenum wesentlech eropgaang nodeems d'NLRP3-Inflammasom blockéiert gouf (t(12) = 2.902, P = 0.0133).Duodenal Stoffer gefierft mat HE gewisen, am Verglach zu negativ Kontroll behandelt mat PBS an MCC950 eleng: (i) G. duodenalis Cyst Infektioun huet zu Schied un den Duodenal Villi gefouert (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488 ) an Krypta Atrophie (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) Duodenum vu Mais infizéiert mat G. duodenalis Zysten a behandelt mat MCC950 Inhibitoren.Duodenal Villi goufen beschiedegt an dout (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) mat Atrophie a Krypta Verzweigung (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) an.Dës Resultater suggeréieren datt d'NLRP3-Inflammasom eng Roll bei der Reduktioun vun der Pathogenizitéit vu G. duodenalis spillt.
Roll vun NLRP3 inflammasom an Giardia Duodenum Infektioun.Mais goufen gavaged (iv) mat duodenococcal cysts an dann behandelt mat oder ouni MCC950 (ip).Single Behandlung Gruppen mat PBS oder MCC950 sech als Kontrollen benotzt.Experimentell Grupp a Behandlungsregime.b D'Kierpergewiicht vu Mais an all eenzel vun de verschiddene Behandlungsgruppen gouf fir 7 Deeg iwwerwaacht.Den Ënnerscheed tëscht der G. duodenalis Infektiounsgrupp an der G. duodenalis + MCC950 Infektiounsbehandlungsgrupp gouf duerch T-Test analyséiert mat der SPSS Software Versioun 22.0.Asterisken weisen bedeitend Differenzen bei *P<0,05, **P<0,01 oder ***P<0,001.c Parasitesch Belaaschtung gouf festgeluecht andeems d'Zuel vun den Trophozoiten an Duodenal Lavage Flëssegkeet zielt.Den Ënnerscheed tëscht der G. duodenalis Infektiounsgrupp an der G. duodenalis + MCC950 Infektiounsbehandlungsgrupp gouf duerch T-Test analyséiert mat der SPSS Software Versioun 22.0.Asterisken weisen bedeitend Differenzen bei *P <0,05.d Hematoxylin an Eosin (H&E) Faarfresultater vun der Duodenal Histopathologie.Roude Pfeile weisen Schued un de Villi, gréng Pfeile weisen Schued un de Krypta.Skala Bar: 100 µm.e, f Statistesch Analyse vun duodenal villus Héicht a Maus Krypta Héicht.Asterisken weisen bedeitend Differenzen bei *P<0,05 an **P<0,01 un.D'Resultater ginn aus 7 onofhängege biologeschen Experimenter geholl.BW, Kierpergewiicht;ig, intragastrisch Liwwerung Wee;ip, intraperitoneal Liwwerung Wee;ns, net bedeitend (P> 0,05);PBS, phosphat gebufferten Salins;WT, Wild Typ
D'Sekretioun vun IL-1β ass en Zeechen vun der Entzündungsaktivéierung.Fir festzestellen, ob G. duodenalis alpha-2 Giardine an Alpha-7.3 Giardine den NLRP3 Hostinflammasom in vivo aktivéieren, hu mir onbehandelt WT Mais (Sham Group) an NLRP3 inflammasom-blockéiert Mais (MCC950 inhibited Behandlungsgrupp) benotzt.Eng detailléiert Schema vum Experiment gëtt an der Figur 4a gewisen.Experimentell Gruppen bestoung aus Mais behandelt mat PBS, G. duodenalis cyst Behandlung vun gavage, intramuscular Sprëtz vun pcDNA3.1, an intramuscular Sprëtz vun pcDNA3.1 (+) -alpha-2 Giardine oder pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine.Am 7. Dag no der intramuskulärer Verwaltung vum rekombinante Plasmid gouf Serum gesammelt an den Niveau vun IL-1β an all Grupp bestëmmt.Wéi an der Figur 4b gewisen, an der MOCK Grupp: (ech) am Verglach zu der PBS Grupp, pcDNA3.1 Behandlung hat kee groussen Effekt op IL-1β secretion (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), awer, IL-β secretion war bedeitend an der G. duodenalis cyst Grupp (ANOVA, F (4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine an pcDNA3 erhéicht.1- Intramuskulär Injektioun vun Alpha-7.3 Giardine bedeitend erhéicht Serum IL-1β Niveauen (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 Giardine induzéiert héich Niveauen vun IL -1β Sekretioun an der pcDNA3.1-alpha-2 Giardine intramuskulär Injektiounsgrupp (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Am Verglach mat all Grupp an der MCC950 Behandlungsgrupp an der MOCK Grupp: (i) IL-1β Sekretiounsniveauen an der PBS Kontrollgruppe an der pcDNA3.1 Kontrollgruppe sinn zu engem gewësse Mooss erofgaang nodeems de MCC950 Inhibitor blockéiert gouf, awer den Ënnerscheed war net bedeitendst (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) no Spär MCC950., IL-1β Sekretioun war wesentlech reduzéiert an der G. duodenalis cyst-infizéiert Grupp, der pcDNA3.1-alpha-2 Giardine Grupp, an der pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine Grupp (G. duodenalis: ANOVA, F (9) , 58) = 3.540, P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA5, F(9 ) = 3,540, P = 0,0164).Dës Resultater suggeréieren datt Alpha-2 Giardine an Alpha-7.3 Giardine d'Aktivatioun vum NLRP3 Inflammasom in vivo vermëttelen.
pcDNA3.1 (+) -giardines aktivéieren den NLRP3 Host inflammasom in vivo.Mais goufen immuniséiert (IM) mat rekombinant eukaryoteschen Ausdrockplasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 Giardine oder pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 Giardine an duerno mat MCC950 (ip; MCC950 Grupp) behandelt oder net (Dummy Grupp) ).D'PBS oder pcDNA3.1 (+) Plasmid Behandlung Grupp war als negativ Kontroll benotzt, de G. duodenalis cyst Behandlung Grupp war als positiv Kontroll benotzt.Experimentell Grupp a Behandlungsregime.b Serumniveauen vun IL-1β bei Mais goufen um Dag 7 duerch ELISA Assay gemooss.D'Ënnerscheeder tëscht de Gruppen an der MOCK-Grupp goufen analyséiert mat enger Manéier ANOVA, an Differenzen tëscht der MOCK-Grupp an der MCC950-Grupp goufen analyséiert mat dem T-Test vun der SPSS Software Versioun 22.0.Asterisken weisen bedeitend Differenzen tëscht Behandlungsgruppen an der MOCK-Grupp, *P<0.05 an ***P<0.001;Dollar Zeechen ($) weisen bedeitend Differenzen tëscht all Grupp an der MOCK Grupp an der MCC950 Grupp bei P<0.05.Resultater vu siwen onofhängege biologeschen Experimenter.i, intramuskulär Injektioun, ns, net bedeitend (P > 0,05)
Fir den Effet vun Alpha-2 an Alpha-7.3 Giardine-mediéiert Aktivatioun vun der NLRP3 Host inflammasom op G. duodenalis Infektivitéit z'ënnersichen, hu mir WT C57BL /6 Mais benotzt an alpha-2 Giardine an Alpha-7.3 Giardine injizéiert.de plasmid war intramuscularly injizéiert, no 3 Deeg duerch d'gastric Rouer vun der G. duodenalis cyst, no deem d'Mais sech fir 7 Deeg observéiert.Eng detailléiert Schema vum Experiment gëtt an der Fig. 5a gewisen.D'Kierpergewiicht vun all Maus war all Dag gemooss, Echantillon vun frësch ausléisen Otemschwieregkeeten sech op de 7. Dag no Administratioun duerch eng gastric Rouer gesammelt, d'Zuel vun trophozoites war gemooss, an histopathological Ännerungen observéiert goufen.Wéi an der Figur 5b gewisen, mat der Erhéijung vun der Fütterungszäit, ass de BW vu Mais an all Grupp graduell eropgaang.De MT vu Mais huet ugefaang op den 3. Dag no der intragastrescher Verwaltung vu G. duodenalis Zysten erof ze goen, an dann graduell erop.Aktivatioun vum NLRP3 Inflammasom induzéiert duerch intramuskulär Injektioun vun Alpha-2 Giardine an Alpha7.3 Giardine huet däitlech Gewiichtsverloscht bei Mais ofgeschwächt (Dag 1: pcDNA3.1-alpha-2 Giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0,9754 Dag 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Dag 2: pcDNA3.1-alpha-2 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Dag 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dag 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 Dag 4: pcDNA3.1-alpha-2 giard; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dag 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P <0,0001, Dag 5: pcDNA3.1-alpha - 2 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 Dag 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 Dag 6: pcDNA3. alpha-2 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Dag 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dag 7: pcDNA3.1-alpha-2 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dag 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).D'parasitic Laascht war am Ausléiser évaluéieren (Figebam. 5c).Am Verglach mat der onbehandelt positiver Kontroll an der Grupp, déi mam eidele pcDNA3.1 Vektor injizéiert gouf, gouf d'Zuel vu G. duodenalis Trophozoiten wesentlech reduzéiert an de Gruppen, déi mat α-2 Giardine an α-7,3 Giardine (pcDNA3.1-alpha injizéiert goufen) -2 Giardin : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Zousätzlech war Giardine alfa-7.3 méi Schutzmoossnamen bei Mais wéi Giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).D'Resultater vun HE staining sinn an Fig.5 d-f.Mais injizéiert mat Alpha-2 Giardine an Alpha-7.3 Giardine hu manner Duodenal Tissue Läsionen, manifestéiert duerch Villusschued, am Verglach mat Mais injizéiert mat G. duodenalis a Mais injizéiert mat G. duodenalis a Kombinatioun mat engem eidelen pcDNA3 Vektor .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 Giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 oder P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 Giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 oder P = 0,0055) a reduzéierter Kryptoatrophie (pcDNA3.1-alpha-2 Giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 oder P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA giardine , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 oder P = 0,0191).Dës Resultater suggeréieren datt Alpha-2 Giardine an Alpha-7,3 Giardine d'Infektivitéit vu G. duodenalis reduzéieren andeems d'NLRP3 Inflammasom in vivo aktivéiert gëtt.
Roll vun pcDNA3.1 (+) -Giardins an G. duodenalis Infektioun.Mais goufen immunized (IM) mat rekombinant eukaryoteschen Ausdrock plasmids pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine oder pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine an dann erausgefuerdert mat G. duodenalis cysts (ig).D'PBS Grupp an der pcDNA3.1 (+) + ausléisen cyst Behandlung Grupp sech als negativ Kontroll Gruppen benotzt, an der Ausléiser cyst Behandlung Grupp war als positiv Kontroll Grupp benotzt.Experimentell Grupp a Behandlungsregime.b D'MT vu Mais an all eenzel vun de verschiddene Behandlungsgruppen gouf fir 7 Deeg no der Erausfuerderung iwwerwaacht.Asterisken weisen bedeitend Differenzen tëscht Gruppen an der G. duodenalis Grupp an der pcDNA3.1(+)-alpha-2 Giardine Grupp, *P <0.05, **P <0.01, an ***P <0.001;d'Dollar Zeechen ($) weist e wesentlechen Ënnerscheed tëscht all Grupp vu G. duodenalis an der pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 Jardinegrupp, $$P<0.01 an $$$P<0.001.c Parasitic Laascht war vun zielen d'Zuel vun trophozoites an 1 ml vun ausléisen lavage aus dem Ausléiser (3 cm laang) an ausgedréckt wéi d'Zuel vun Parasiten pro cm vun Ausléiser.D'Ënnerscheeder tëscht der G. duodenalis Infektioun Grupp, der pcDNA3.1 (+) -alpha-2 Giardine Grupp, an der pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 Giardine Grupp sech duerch eent-Manéier ANOVA benotzt SPSS Software Versioun 22.0 analyséiert.Asterisken weisen bedeitend Differenzen bei **P<0,01 an ***P<0,001 un.d Histopathologesch Verännerungen am Duodenum.Roude Pfeile weisen Schued un de Villi, gréng Pfeile weisen Schued un de Krypta.Skala Bar: 100 µm.e, f Statistesch Analyse vun der Maus Duodenal Villus Héicht (e) a Krypta Héicht (f).D'Ënnerscheeder tëscht de Gruppen an der Figur 1d goufen duerch One-Way ANOVA analyséiert mat der SPSS Software Versioun 22.0.Asterisken weisen bedeitend Differenzen bei *P<0,05 an **P<0,01 un.Resultater vu siwen onofhängege biologeschen Experimenter.ns, net bedeitend (P > 0,05)
Giardia Duodenum ass e bekannten Darmparasit vu Mënschen an aner Mamendéieren, déi Giardiasis verursaacht.Am 2004 gouf et an der WHO Neglected Diseases Initiative abegraff wéinst senger héijer Prävalenz iwwer 6 Joer, besonnesch a Gemeinschaften mat nidderegen sozioekonomesche Status [32].Den gebuerene Immunsystem spillt eng kritesch Roll an der Immunantwort op G. duodenalis Infektioun.Mouse macrophages goufen gemellt G. duodenalis ze engulf an ëmbréngen vun extracellular Fallen Fräisetzung [33].Eis fréier Studien hu gewisen datt G. duodenalis, en net-invasiv extrazelluläre Parasit, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, an NLRP3 entzündleche Signalweeër a Mausmakrophagen aktivéiert fir Hostentzündungsreaktiounen ze reguléieren, a verëffentlecht GEV kann dëse Prozess verbesseren.13], 24] Eng.Wéi och ëmmer, déi exakt PAMPs involvéiert an NLRP3 inflammasomreguléierter Entzündung am GEV an d'Roll vum NLRP3 inflammasom an der Giardiasis bleiwen opgekläert.Fir Liicht op dës zwou Froen ze werfen, hu mir dës Etude gemaach.
Den NLRP3 Inflammasom ass am Zytoplasma vun Immunzellen lokaliséiert a ka vu verschiddene Partikelen wéi Harnsäurekristalle, Toxine, Bakterien, Viren a Parasiten aktivéiert ginn.A bakteriell Studien goufen Toxine als Schlëssel PAMPs identifizéiert, déi entzündlech Sensoren aktivéieren, wat zu Entzündung an Zell Doud féiert [34].E puer strukturell divers Toxine, wéi Hämolysin aus Staphylococcus aureus [35] an Escherichia coli [36], Hämolysin BL (HBL) aus Enterotoxin (NHE) [37], induzéieren d'Aktivatioun vun NLRP3 Entzündung.Viral Studien hu gewisen datt Virulenzproteine ​​wéi SARS-COV-2 Enveloppe (E) Protein [38] an Zika Virus NS5 Protein [39] wichteg PAMPs sinn, déi vum NLRP3 Rezeptor unerkannt sinn.A Parasitstudien hu vill Parasiten gemellt mat der Entzündungsaktivéierung vum Host, wéi Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], a Leishmania [42].Déi dichte granule Proteinen GRA35, GRA42, an GRA43, verbonne mat der virulence vun Toxoplasma gondii, sinn fir d'Aféierungs- vun pyroptosis zu Lewis Rat macrophages néideg [43].Zousätzlech, hunn e puer Leishmania Studien op eenzel Molekülle konzentréiert an der NLRP3 inflammasome involvéiert, wéi Parasit Membran lipophosphoglycan [44] oder Zénk metalloprotease [45].Ënnert der Annexin-wëll Alpha-Giardin Famill vun Genen, huet Alpha-1 Giardin e Potential Impfstoff Kandidatur suergt Schutz géint G. duodenalis an enger Maus Modell gewise ginn [18].An eiser Etude, ausgewielt mir G. duodenalis virulence Faktoren Alpha-2 an Alpha-7,3 giardines, déi eenzegaarteg zu Giardia sinn awer relativ manner gemellt.Dës zwee Zilgenen goufen an den pcDNA3.1 (+) eukaryoteschen Ausdrocksystemvektor gekloont fir d'Analyse vun der Entzündungsaktivéierung.
An eisem Mausmodell déngen gekleete Caspase Fragmenter als Markéierer vun der entzündlecher Aktivatioun.Beim Stimulatioun interagéiert NLRP3 mat ASC, rekrutéiert Procaspasen, a generéiert aktiv Caspasen déi pro-IL-1β a pro-IL-18 a reife IL-1β an IL-18 spalten, respektiv -18.Entzündlech Kaspasen (Caspasen-1, -4, -5 an -11) sinn eng konservéiert Famill vu Cysteinproteasen déi kritesch sinn fir d'gebuerene Verteidegung an an der Entzündung a programméierten Zell Doud involvéiert sinn [46].Caspase-1 ass duerch kanonesch inflammasomes ageschalt [47], iwwerdeems caspases-4, -5, an -11 während der Formatioun vun atypesch inflammasomes gespléckt ginn [48].An dëser Etude, hu mir Maus peritoneal macrophages als Modell benotzt an ënnersicht p20 caspase-1 gespléckt Caspase-1 als Marker vun Host NLRP3 inflammation Aktivatioun an Studien vun G. duodenalis Infektioun.D'Resultater weisen datt vill Alpha-Giardine verantwortlech sinn fir déi typesch Aktivatioun vun der Entzündung, wat konsequent mat der Entdeckung vu Schlësselvirulenzmoleküle involvéiert ass a Bakterien a Viren.Allerdéngs ass eis Etude nëmmen eng virleefeg Écran an et ginn aner Molekülle datt Net-klassesch inflammasomes aktivéieren kann, wéi eis virdrun Etude souwuel klassesch an Net-klassesch inflammasomes zu G. duodenalis Wonn fonnt [13].Fir weider ze bestëmmen ob de generéierte p20 Caspase-1 mam NLRP3 inflammasome assoziéiert ass, transfektéiert mir Alpha-2 an Alpha-7.3 Giardins an Maus peritoneal Makrophagen fir Schlësselmolekül Protein Ausdrock Niveauen an ASC Oligomeriséierung Niveauen ze bestëmmen, confirméiert datt béid α-Giardins aktivéieren. inflammasom NLRP3.Eis Resultater sinn liicht anescht wéi déi vum Manko-Prykhoda et al., Déi gemellt datt Stimulatioun vu Caco-2 Zellen mat G. muris oder E. coli EPEC Stämme eleng d'Fluoreszenzintensitéit vun NLRP3, ASC a Caspase-1 erhéijen, obwuel net vill, iwwerdeems wéi costimulation vun G. muris an E. coli den Niveau vun dräi Proteinen fräi [49].Dës Diskrepanz kann wéinst Differenzen an der Auswiel vu Giardia Arten, Zelllinnen a primär Zellen sinn.Mir hunn och zu VIVO Assays mat MCC950 an 5-Woch-ale weiblech WT C57BL /6 Mais gemaach, déi méi ufälleg fir G. duodenalis sinn.MCC950 ass e potenten a selektive klenge Molekül NLRP3 Inhibitor deen kanonesch an net-kanonesch NLRP3 Aktivatioun bei nanomolare Konzentratioune blockéiert.MCC950 hemmt d'NLRP3 Aktivatioun awer beaflosst net d'Aktivatioun vun AIM2, NLRC4, an NLRP1 entzündleche Weeër oder TLR Signalweeër [27].MCC950 blockéiert NLRP3 Aktivatioun awer hemmt net NLRP3 Initiatioun, K + Efflux, Ca2+ Influx oder d'Interaktioun tëscht NLRP3 an ASC;amplaz, et bremst NLRP3 inflammasome Aktivatioun vun ASC oligomerization Spär [27].Dofir hu mir MCC950 an enger VIVO Etude benotzt fir d'Roll vum NLRP3 inflammasome no Giardine Sprëtz ze bestëmmen.Aktivéiert caspase-1 p10 spalt pro-inflammatoresch Zytokine pro-IL-1β a pro-IL-18 a reife IL-1β an IL-18 [50].An dëser Etude, Serum IL-1β Niveauen an giardine-behandelt Mais mat oder ouni MCC950 goufen als Luucht benotzt ob der NLRP3 inflammasom aktivéiert war.Wéi erwaart, reduzéiert MCC950 Behandlung däitlech Serum IL-1β Niveauen.Dës Donnéeën weisen kloer datt G. duodenalis giardin alfa-2 a giardin alfa-7.3 fäeg sinn den NLRP3 Mausinflammasom z'aktivéieren.
Bedeitend Donnéeën, déi an de leschte Jorzéngt gesammelt goufen, hunn bewisen datt IL-17A de Meeschterregulator vun der Immunitéit géint G. muris ass, IL-17RA Signaliséierung induzéiert, antimikrobial Peptiden produzéiert an d'Ergänzungsaktivéierung reguléiert [51].Wéi och ëmmer, d'Giardia Infektioun geschitt méi dacks bei jonken Erwuessener, an et gouf gemellt datt d'Giardia Infektioun bei jonke Mais d'IL-17A Äntwert net aktivéiert fir säi Schutzeffekt auszeüben [52], wouduerch d'Fuerscher no aner immunomodulatoresch Giardia sichen.Mechanismen vun der Helminth Infektioun.D'Autoren vun enger rezenter Etude berichten datt G. muris den NLRP3-Inflammasom vun E. coli EPEC aktivéiere kann, wat d'Produktioun vun antimikrobiellen Peptiden fördert a seng Befestigungskapazitéit an d'Zuel vun den Trophozoiten am Darmtrakt reduzéiert, an doduerch d'Gravitéit vum Colon reduzéiert. Krankheeten duerch Bacilli verursaacht [49].Den NLRP3 Inflammasom ass an der Entwécklung vu verschiddene Krankheeten involvéiert.Studien hu gewisen datt Pseudomonas aeruginosa Autophagie an Makrophagen ausléist fir Zell Doud ze vermeiden, an dëse Prozess hänkt vun der Aktivatioun vum NLRP3 inflammasome of [53].Fir N. caninum, reaktiv Sauerstoff Arten-mediéiert Aktivatioun vun der NLRP3 inflammasom limitéiert seng Replikatioun am Host, sou datt et e potenziell therapeutescht Zil ass [9].Paracoccidioides brasiliensis gouf fonnt fir d'Aktivatioun vum NLRP3-Inflammasom a Mausknochenmark ofgeleet dendritesch Zellen ze induzéieren, wat zu der Verëffentlechung vum entzündlechen Zytokin IL-1β resultéiert, wat eng kritesch Roll an der Hostverteidegung spillt [10].Verschidde Leishmania Arten, dorënner L. amazonensis, L. major, L. braziliensis a L. infantum chagasi, aktivéieren NLRP3 an ASC-ofhängeg Caspase-1 an Makrophagen, souwéi Leishmania Infektioun.Parasit Replikatioun ass verbessert an Mais defizit am NLRP3 /ASC /caspase-1 Gentherapie [11].Zamboni et al.Leishmania Infektioun gouf gemellt fir d'Aktivatioun vum NLRP3-Inflammasom a Makrophagen ze induzéieren, wat d'intrazellulär Parasit-Replikatioun limitéiert.Also kann Leishmania d'NLRP3 Aktivatioun als Vermeidungsstrategie hemmen.An vivo Studien, huet d'NLRP3 inflammasome zu der Eliminatioun vun Leishmania bäigedroen, awer net Stoffer Afloss [54].Ëmgekéiert, an helminthiasis Studien, Aktivatioun vun der NLRP3 inflammasome gedréckt der Schutzmoossnamen Immunitéit vum Provider géint gastrointestinal helminthiasis [12].Shigella ass eng vun den Haaptbakterien déi Diarrhoe weltwäit verursaachen.Dës Bakterien kënnen d'IL-1β Produktioun duerch P2X7 Rezeptor-mediéiert K + Efflux induzéieren, reaktiv Sauerstoffaarten, lysosomal Säurung a Mitochondrial Schued.D'NLRP3 inflammasom negativ reguléieren phagocytosis an bactericidal Aktivitéit vun macrophages géint Shigella [55].Plasmodium Studien hu gewisen datt AIM2, NLRP3 oder caspase-1-mangel Mais mat Plasmodium infizéiert héich Niveauen vun Typ 1 Interferon produzéiere a si méi resistent géint Plasmodium Infektioun [56].Wéi och ëmmer, d'Roll vun Alpha-2 Giardine an Alpha-7.3 Giardine bei der Induktioun vun der pathogener Aktivatioun vun NLRP3 Entzündung bei Mais ass onkloer.
An dëser Studie huet d'Inhibitioun vum NLRP3-Inflammasom duerch MCC950 d'BW reduzéiert an d'Zuel vun den Trophozoiten an der Intestinal Lavage Flëssegkeet bei Mais erhéicht, wat zu méi schwéiere pathologesche Verännerungen am Duodenalgewebe resultéiert.Alpha-2 Giardine an Alpha-7.3 Giardine aktivéieren d'Hostmaus NLRP3 Inflammasom, erhéijen d'Kierpergewiicht vun der Maus, reduzéieren d'Zuel vun den Trophozoiten an der Intestinal Lavage Flëssegkeet, a linderen pathologesch Duodenal Läsionen.Dës Resultater suggeréieren datt G. duodenalis den NLRP3 Host-Inflammasom iwwer Alpha-2 Giardine an Alpha-7,3 Giardine aktivéiere kann, wat d'Pathogenizitéit vu G. duodenalis bei Mais reduzéiert.
Zesummen beweisen eis Resultater datt Alpha-2 an Alpha-7.3 Giardine d'Aktivatioun vum NLRP3 Hostinflammasom induzéieren an d'Infektivitéit vu G. duodenalis bei Mais reduzéieren.Dofir sinn dës Moleküle villverspriechend Ziler fir d'Préventioun vu Giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: en Iwwerbléck.Et gouf viru kuerzem opgedeckt datt Pat Inflamm allergesch fir Drogen ass.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: eng Iwwerpréiwung vun der Pharmakotherapie.Expert Meenung vun engem Apdikter.2007;8: 1885-902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, Drogenresistenz an d'Entdeckung vun neien Ziler.Infizéiert Disord Drogenziler.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etc. NLRP3 entzündlech an entzündlech Krankheeten.Oxid Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. D'Roll vum Entzündung an der Darm Entzündung a Kriibs.Gastroenterologie.2011;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical an atypesch NLRP3 inflammasom Aktivéierung op der Kräizung vun der Immuntoleranz an Darm Entzündung.pre-immun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-mediéiert NLRP3 inflammasom Aktivéierung ass an der Äntwert op N. caninum Infektioun involvéiert.Parasitsvektor.2020; 13:449.