Merci fir besicht Nature.com.D'Browser Versioun déi Dir benotzt huet limitéiert CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript maachen.
Genvektore fir d’Behandlung vu pulmonaler zystesch Fibrose mussen op déi konduktiv Atemwege gezielt ginn, well periphere Lungetransduktioun keen therapeuteschen Effekt huet.D'Effizienz vun der viraler Transduktioun ass direkt mat der Residenzzäit vum Carrier verbonnen.Wéi och ëmmer, Liwwerungsflëssegkeeten wéi Genträger diffusen natierlech an d'Alveoli wärend der Inhalatioun, an therapeutesch Partikele vun iergendenger Form gi séier duerch mucociliary Transport geläscht.D'Verlängerung vun der Residenzzäit vu Genträger am Atmungstrakt ass wichteg awer schwéier z'erreechen.Carrier-konjugéiert magnetesch Partikelen, déi op d'Uewerfläch vum Atmungstrakt geriicht kënne ginn, kënne regional Zilsetzung verbesseren.Wéinst Probleemer mat in vivo Imaging ass d'Behuele vu sou klenge magnetesche Partikelen op der Loftweeër Uewerfläch an der Präsenz vun engem applizéierte Magnéitfeld schlecht verstanen.D'Zil vun dëser Etude war Synchrotron Imaging ze benotzen fir in vivo d'Bewegung vun enger Serie vu magnetesche Partikelen an der Trachea vun anästhetiséierte Ratten ze visualiséieren fir d'Dynamik an d'Muster vum Verhalen vun eenzel a bulk Partikelen in vivo ze studéieren.Mir hunn dann och bewäert ob d'Liwwerung vu lentiviralen magnetesche Partikel an der Präsenz vun engem Magnéitfeld d'Effizienz vun der Transduktioun an der Rattentrachea erhéijen.Synchrotron Röntgenbildung weist d'Behuele vu magnetesche Partikelen a stationären a bewegende magnetesche Felder in vitro an in vivo.D'Partikel kënnen net einfach iwwer d'Uewerfläch vu liewege Loftweeër mat Magnete geschleeft ginn, awer während dem Transport konzentréiere sech Oflagerungen am Gesiichtsfeld, wou d'Magnéitfeld am stäerkste ass.Transduktiounseffizienz gouf och sechsfach erhéicht wann lentiviral magnetesch Partikel a Präsenz vun engem Magnéitfeld geliwwert goufen.Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater datt lentiviral magnetesch Partikelen a Magnéitfelder wäertvoll Approche kënne sinn fir d'Genvektorzielung an d'Transduktiounsniveauen an de konduktiven Airways in vivo ze verbesseren.
Cystesch Fibrose (CF) gëtt verursaacht duerch Variatiounen an engem eenzegen Gen genannt CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR).De CFTR Protein ass en Ionkanal deen a ville Epithelzellen am ganze Kierper präsent ass, och d'Atmwege, e wichtege Site an der Pathogenese vun der zystescher Fibrose.Mängel am CFTR féieren zu anormalen Waassertransport, Dehydratioun vun der Airway Uewerfläch, a verréngert Airway Surface Fluid Layer (ASL) Déift.Et behënnert och d'Fäegkeet vum mucociliary Transport (MCT) System fir d'Atmwege vun inhaléierte Partikelen a Pathogenen ze läschen.Eist Zil ass et eng lentiviral (LV) Gentherapie z'entwéckelen fir déi richteg Kopie vum CFTR Gen ze liwweren an ASL, MCT a Lungegesondheet ze verbesseren, a weider nei Technologien z'entwéckelen déi dës Parameteren in vivo1 moosse kënnen.
LV Vecteure sinn ee vun de féierende Kandidaten fir zystesch Fibrose Gentherapie, haaptsächlech well se den therapeutesche Gen permanent an d'Basalzellen vun der Airway (Airway Stammzellen) integréiere kënnen.Dëst ass wichteg well se normal Hydratatioun a Schleimklärung restauréiere kënnen andeems se sech a funktionell genkorrigéiert Loftweeër Uewerflächzellen ënnerscheeden, déi mat zystesch Fibrose verbonne sinn, wat zu liewenslaange Virdeeler resultéiert.LV Vecteure musse géint déi konduktiv Atemwege geriicht ginn, well dëst ass wou d'Lungebedeelegung un CF ufänkt.D'Liwwerung vum Vektor méi déif an d'Lunge kann zu alveolar Transduktioun féieren, awer dëst huet keen therapeuteschen Effekt an der zystesch Fibrose.Wéi och ëmmer, Flëssegkeete wéi Genträger migréieren natierlech an d'Alveoli wann se no der Gebuert inhaléiert ginn3,4 an therapeutesch Partikel gi séier duerch MCTs an d'Mëndlech Huelraim verdriwwen.D'Effizienz vun der LV-Transduktioun ass direkt verbonne mat der Längt vun der Zäit wou de Vektor no bei den Zilzellen bleift fir zellulär Opnahm ze erlaben - "Residenzzäit" 5 déi liicht verkierzt gëtt duerch typesch regional Loftfloss souwéi koordinéiert Opnahm vu Schleim a MCT-Partikel.Fir zystesch Fibrose ass d'Fäegkeet fir d'LV Residenzzäit an den Atemweeër ze verlängeren ass wichteg fir héich Transduktiounsniveauen an dësem Beräich z'erreechen, awer ass bis elo Erausfuerderung.
Fir dës Hürd ze iwwerwannen, proposéiere mir datt LV magnetesch Partikelen (MPs) op zwou komplementär Weeër hëllefe kënnen.Als éischt kënne se duerch e Magnéit op d'Atemweguewerfläch guidéiert ginn fir d'Ziel ze verbesseren an d'Genträgerpartikelen ze hëllefen am richtege Gebitt vun der Airway ze sinn;an ASL) réckelen an d'Zellschicht 6. Deputéiert gi wäit benotzt als geziilte Medikamentliwwerungsfahrzeuge wa se un Antikörper, Chemotherapie Medikamenter oder aner kleng Molekülen binden, déi un Zellmembranen hänken oder un hir jeweileg Zelloberfläche Rezeptoren binden an op Tumorplazen accumuléieren an Präsenz vun statesch Elektrizitéit.Magnéitfelder fir Kriibstherapie 7. Aner "hyperthermesch" Methoden zielen fir Tumorzellen ëmzebréngen andeems Deputéierten erhëtzen wann se op oszilléierend Magnéitfelder ausgesat sinn.De Prinzip vun der magnetescher Transfektioun, an deem e Magnéitfeld als Transfektiounsmëttel benotzt gëtt fir den Transfer vun DNA an Zellen ze verbesseren, gëtt allgemeng in vitro benotzt mat enger Rei vun net-viralen a virale Genvektore fir schwéier ze transduzéieren Zelllinnen. ..D'Effizienz vun der LV-Magnetotransfektioun mat der Liwwerung vum LV MP in vitro an enger Zelllinn vum mënschleche Bronchialepithel an der Präsenz vun engem statesche Magnéitfeld gouf etabléiert, wat d'Effizienz vun der Transduktioun ëm 186 Mol erhéicht am Verglach mam LV-Vektor eleng.LV MT gouf och op en in vitro Modell vun der zystescher Fibrose applizéiert, wou magnetesch Transfektioun d'LV-Transduktioun an de Loft-Flësseg-Interfacekulturen ëm e Faktor vun 20 an der Präsenz vun zystesch Fibrose-Sputum erhéicht huet10.Wéi och ëmmer, in vivo Organmagnetotransfektioun huet relativ wéineg Opmierksamkeet kritt a gouf nëmmen an e puer Déierestudien11,12,13,14,15 bewäert, besonnesch an de Longen16,17.Wéi och ëmmer, d'Méiglechkeete vun der magnetescher Transfektioun an der Lungentherapie bei der zystescher Fibrose si kloer.Tan et al.(2020) sot datt "eng Validatiounsstudie iwwer effektiv pulmonaler Liwwerung vu magnetesche Nanopartikelen de Wee fir zukünfteg CFTR Inhalatiounsstrategien erweidert fir klinesch Resultater bei Patienten mat zystesch Fibrose ze verbesseren"6.
D'Behuele vu klenge magnetesche Partikelen op der Uewerfläch vum Atmungstrakt an der Präsenz vun engem applizéierte Magnéitfeld ass schwéier ze visualiséieren an ze studéieren, an dofir si se schlecht verstanen.An anere Studien hu mir eng Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) Method entwéckelt fir net-invasiv Imaging a Quantifikatioun vu Minutte in vivo Ännerungen an der ASL18 Tiefe a MCT19 Verhalen,20 fir direkt Gaskanal Surface Hydratatioun ze moossen. a gëtt als fréie Indikator Behandlungseffizienz benotzt.Zousätzlech benotzt eis MCT Scoringmethod 10-35 µm Duerchmiesser Partikele besteet aus Aluminiumoxid oder héije Refraktiounsindexglas als MCT Markéierer siichtbar mat PB-PCXI21.Béid Methode si gëeegent fir eng Rei vu Partikeltypen ze bilden, dorënner Deputéierten.
Wéinst der héijer raimlecher an zäitlecher Resolutioun sinn eis PB-PCXI-baséiert ASL an MCT Assays gutt geegent fir d'Dynamik an d'Verhalensmuster vun eenzelen a bulkpartikelen in vivo ze studéieren fir eis ze hëllefen MP Gen Liwwerungsmethoden ze verstoen an ze optimiséieren.D'Approche, déi mir hei benotzen, baséiert op eise Studien mat der SPring-8 BL20B2 Beamline, an där mir d'Flëssegkeetsbewegung visualiséiert hunn no der Liwwerung vun enger Dosis vun engem Dummy Vektor an d'Nasal a Pulmonal Atemwege vu Mais fir ze hëllefen eis heterogen Genausdrockmuster ze erklären observéiert. an eisem Gen.Déierstudien mat enger Carrierdosis vun 3,4.
D'Zil vun dëser Etude war de PB-PCXI Synchrotron ze benotzen fir in vivo Beweegunge vun enger Serie vun Deputéierten an der Trachea vu liewegen Ratten ze visualiséieren.Dës PB-PCXI Imaging Studien goufen entworf der MP Serie ze Test, Magnéitfeld Kraaft, a Standuert hiren Effekt op MP Bewegung ze bestëmmen.Mir hunn ugeholl datt en externt Magnéitfeld dem geliwwert MF hëllefe géifen ze bleiwen oder an d'Zilgebitt ze bewegen.Dës Studien hunn eis och erlaabt Magnéitkonfiguratiounen ze bestëmmen déi d'Quantitéit u Partikelen, déi an der Trachea no der Oflagerung bleiwen, maximéieren.An enger zweeter Serie vu Studien hu mir gezielt dës optimal Konfiguratioun ze benotzen fir d'Transduktiounsmuster ze demonstréieren, déi aus der in vivo Liwwerung vun LV-MPs op d'Ratten Airways resultéiert, op der Virgab datt d'Liwwerung vun LV-MPs am Kontext vum Airway Targeting géif resultéieren. an erhéicht LV Transduktiounseffizienz..
All Déierstudien goufen am Aklang mat de Protokoller duerchgefouert vun der University of Adelaide (M-2019-060 a M-2020-022) an dem SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.D'Experimenter goufen am Aklang mat den Empfehlungen vun ARRIVE duerchgefouert.
All Röntgenbilder goufen op der BL20XU Beamline am SPring-8 Synchrotron a Japan geholl mat engem Setup ähnlech wéi dee virdru beschriwwen21,22.Kuerz gesot, d'experimentell Këscht war 245 m vum Synchrotronlagerring.Eng Probe-zu-Detektor-Distanz vun 0,6 m gëtt fir Partikelbildstudien benotzt an 0,3 m fir in vivo Imaging Studien fir Phasekontrasteffekter ze kreéieren.E monochromatesche Strahl mat enger Energie vu 25 keV gouf benotzt.D'Biller goufen mat engem héichopléisende Röntgentransducer (SPring-8 BM3) mat engem sCMOS Detektor kaaft.Den Transducer konvertéiert Röntgenstrahlen a siichtbar Liicht mat engem 10 µm décke Scintillator (Gd3Al2Ga3O12), deen dann op den sCMOS-Sensor geriicht gëtt mat engem ×10 (NA 0.3) Mikroskopobjektiv.De sCMOS Detektor war en Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mat enger Arraygréisst vun 2048 × 2048 Pixel an enger rauer Pixelgréisst vu 6,5 × 6,5 µm.Dës Astellung gëtt eng effektiv isotrop Pixelgréisst vun 0,51 µm an e Gesiichtsfeld vun ongeféier 1,1 mm × 1,1 mm.D'Beliichtungsdauer vun 100 ms gouf gewielt fir de Signal-to-Geräusche Verhältnis vu magnetesche Partikelen bannen an ausserhalb vun den Atemweeër ze maximéieren, während d'Bewegungsartefakte miniméiert duerch Atmung.Fir In vivo Studien gouf e schnelle Röntgenschalter am Röntgenwee plazéiert fir d'Stralungsdosis ze limitéieren andeems de Röntgenstrahl tëscht Beliichtungen blockéiert.
LV Medien gouf net an all SPring-8 PB-PCXI Imaging Studien benotzt well d'BL20XU Imaging Chamber net Biosafety Level 2 zertifizéiert ass.Amplaz hu mir eng Rei vu gutt charakteriséiert Deputéiert aus zwee kommerziellen Ubidder ausgewielt, déi eng Rei vu Gréissten, Materialien, Eisenkonzentratioune an Uwendungen ofdecken, - fir d'éischt ze verstoen wéi magnetesch Felder d'Bewegung vun Deputéierten a Glaskapillaren beaflossen, an dann an liewen Airways.Uewerfläch.D'Gréisst vum MP variéiert vun 0,25 bis 18 µm a gëtt aus verschiddene Materialien gemaach (kuckt Tabell 1), awer d'Zesummesetzung vun all Probe, och d'Gréisst vun de magnetesche Partikelen am MP, ass onbekannt.Baséierend op eis extensiv MCT Studien 19, 20, 21, 23, 24, erwaarden mir datt Deputéiert bis zu 5 µm op der Tracheal Airway Uewerfläch gesi kënne ginn, zum Beispill, andeems se konsekutiv Rummen subtrahéieren fir eng verbessert Visibilitéit vun der MP Bewegung ze gesinn.Een eenzegen MP vun 0,25 µm ass méi kleng wéi d'Resolutioun vum Bildapparat, awer PB-PCXI gëtt erwaart fir hire volumetresche Kontrast an d'Bewegung vun der Uewerflächeflëssegkeet ze detektéieren, op där se deposéiert ginn nodeems se deposéiert goufen.
Echantillon fir all MP an der Tabell.1 gouf an 20 μl Glaskapillaren (Drummond Microcaps, PA, USA) mat engem internen Duerchmiesser vun 0,63 mm virbereet.Corpuskuläre Partikele sinn am Waasser verfügbar, während CombiMag Partikelen an der propriétaire Flëssegkeet vum Hiersteller verfügbar sinn.All Röhre ass hallef mat Flëssegkeet gefëllt (ongeféier 11 μl) an op de Probehalter gesat (kuckt Figur 1).D'Glas Kapillaren goufen horizontal op der Bühn an der Imaging Chamber gesat, respektiv, an op de Kante vun der Flëssegkeet positionéiert.En 19 mm Duerchmiesser (28 mm laang) Nickel-Schuel Magnéit aus rare Äerd, Neodym, Eisen a Bor (NdFeB) (N35, Kat. Nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) mat enger Remanenz vun 1,17 T war an engem separat Transfert Dësch ze erreechen Remote änneren Är Positioun während Render-.Röntgenbildung fänkt un wann de Magnéit ongeféier 30 mm iwwer d'Probe positionéiert ass a Biller mat 4 Frames pro Sekonn opgeholl ginn.Wärend der Imaging gouf de Magnéit no beim Glaskapillärröhre bruecht (op enger Distanz vu ronn 1 mm) an duerno laanscht d'Röhre geréckelt fir den Effekt vun der Feldstäerkt a Positioun ze bewäerten.
En In vitro Imaging Setup enthält MP Proben a Glaskapillaren op der Bühn vun der Iwwersetzung vun der xy Probe.De Wee vum Röntgenstrahl ass mat enger roude Punktelinn markéiert.
Wann d'In vitro Visibilitéit vun Deputéierten etabléiert gouf, gouf e Subset vun hinnen in vivo op Wild-Typ weiblech Wistar Albino Ratten (~ 12 Wochen al, ~ 200 g) getest.Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), Midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) a Butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ratten goufen mat Pharma (Japan) Mëschung duerch intraperitoneal Injektioun anästhetiséiert.No der Anästhesie goufe si fir d'Bildgebung virbereet andeems de Pelz ronderëm d'Trachea ofgeschaaft gouf, en endotracheal Tube (ET; 16 Ga intravenös Kanüle, Terumo BCT) agebaut an se an der supine Positioun op enger personaliséierter Imaging Plack mat enger Thermalbeutel immobiliséiert. Kierpertemperatur ze halen.22. D'Billerplack gouf dann op d'Proufbühn an der Imagingbox an engem liichte Wénkel befestegt fir d'Trachea horizontal op d'Röntgenbild ze alignéieren wéi an der Figur 2a.
(a) In vivo Imaging Setup an der SPring-8 Imaging Eenheet, Röntgenstrahlwee markéiert mat roude Punktelinn.(b, c) Tracheal Magnéit Lokaliséierung gouf op afstand mat zwou orthogonal montéiert IP Kameraen duerchgefouert.Op der lénker Säit vum Bild um Bildschierm kënnt Dir d'Draadschleife gesinn, déi de Kapp hält an d'Liwwerkanül, déi am ET-Röhre installéiert ass.
E Fernkontrolléiert Sprëtzpompelsystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mat enger 100 µl Glassprëtz gouf mat enger PE10 Schlauch (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) mat enger 30 Ga Nadel verbonnen.Markéiert de Rouer fir sécherzestellen datt den Tipp an der korrekter Positioun an der Trachea ass wann Dir den Endotracheal Tube asetzt.Mat Hëllef vun enger Mikropumpe gouf d'Sprëtzplunger geläscht an den Tipp vum Röhre gouf an d'MP-Probe taucht fir ze liwweren.De belaaschte Liwwerröhre gouf dann an d'endotracheal Röhre agebaut, an den Tipp am stäerksten Deel vun eisem erwaart ugewandte Magnéitfeld plazéiert.D'Bildacquisitioun gouf kontrolléiert mat engem Atemdetektor verbonne mat eiser Arduino-baséiert Timingbox, an all Signaler (zB Temperatur, Atmung, Shutter oppen / zoumaachen, a Bildacquisitioun) goufen opgeholl mat Powerlab a LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) 22 Wann Imaging Wann de Logement net verfügbar war, goufen zwou IP Kameraen (Panasonic BB-SC382) op ongeféier 90 ° zuenee positionéiert a benotzt fir d'Positioun vum Magnéit relativ zu der Trachea während der Imaging ze kontrolléieren (Figure 2b, c).Fir Bewegungsartefakte ze minimiséieren, gouf ee Bild pro Atem wärend dem terminalen Atmungsflossplateau erfaasst.
De Magnéit ass un der zweeter Stuf befestegt, déi op der Äussewelt vum Bildkierper wäit ewech läit.Verschidde Positiounen a Konfiguratioune vum Magnéit goufen getest, dorënner: an engem Wénkel vun ongeféier 30 ° iwwer der Trachea plazéiert (Konfiguratioune ginn an de Figuren 2a an 3a gewisen);ee Magnéit iwwer dem Déier an deen aneren drënner, mat de Pole fir Attraktioun gesat (Figur 3b)., ee Magnéit iwwer dem Déier an een ënner, mat de Pole fir d'Ofdreiwung gesat (Figure 3c), an ee Magnéit uewen a senkrecht op d'Trachea (Dorënner 3d).Nodeems Dir d'Déier a Magnéit opgeriicht hutt an den MP ënner Test an d'Sprëtzpompel gelueden hutt, liwwert eng Dosis vu 50 µl mat enger Rate vu 4 µl / sec bei der Acquisitioun vu Biller.De Magnéit gëtt dann hin an hier laanscht oder iwwer d'Trachea geréckelt wärend weider Biller erfaasst.
Magnéitkonfiguratioun fir In vivo Imaging (a) ee Magnéit iwwer der Trachea an engem Winkel vun ongeféier 30°, (b) zwee Magnete konfiguréiert fir Attraktioun, (c) zwee Magnete konfiguréiert fir Oflehnung, (d) ee Magnéit uewen a senkrecht zum trachea.Den Beobachter huet vum Mond op d'Lunge duerch d'Trachea erof gekuckt an den Röntgenstrahl ass duerch déi lénks Säit vun der Rat gaangen an ass aus der rietser Säit erausgaang.De Magnéit gëtt entweder laanscht d'Längt vun der Airway oder lénks a riets iwwer der Trachea a Richtung Röntgenstrahl geréckelt.
Mir hunn och probéiert d'Visibilitéit an d'Behuele vu Partikelen an den Atemwege festzeleeën an der Verontreiung vu Mëschung vun Atmung an Häerzgeschwindegkeet.Dofir, um Enn vun der Imaging Period, goufen Déieren mënschlech euthanized wéinst pentobarbital Iwwerdosis (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg /kg ip).E puer Déieren goufen op der Imaging Plattform gelooss, an no der Stopp vun der Atmung an dem Häerzschlag gouf den Imagingprozess widderholl, eng zousätzlech Dosis MP bäigefüügt, wann keen MP op der Airway Uewerfläch sichtbar war.
Déi resultéierend Biller goufen fir flaach an donkel Feld korrigéiert an duerno an e Film zesummegesat (20 Frames pro Sekonn; 15-25 × normal Geschwindegkeet ofhängeg vun der Atmungsrate) mat engem personaliséierte Skript geschriwwen an MATLAB (R2020a, The Mathworks).
All Studien iwwer LV Genvektor Liwwerung goufen an der University of Adelaide Laboratory Animal Research Center gehaal a zielt d'Resultater vum SPring-8 Experiment ze benotzen fir ze bewäerten ob d'LV-MP Liwwerung an der Präsenz vun engem Magnéitfeld den Gentransfer in vivo kéint verbesseren .Fir d'Effekter vum MF a Magnéitfeld ze evaluéieren, goufen zwou Gruppe vun Déieren behandelt: eng Grupp gouf mat LV MF mat Magnéitplazéierung injizéiert, an déi aner Grupp gouf mat enger Kontrollgruppe mat LV MF ouni Magnéit injizéiert.
LV Gentherapie Vecteure goufen benotzt virdrun beschriwwe Methoden 25, 26 generéiert.De LacZ-Vektor dréckt en nuklear lokaliséierte Beta-Galaktosidase-Gen aus, gedriwwen vum MPSV-konstitutiven Promoteur (LV-LacZ), deen e bloe Reaktiounsprodukt an transducéierten Zellen produzéiert, sichtbar op Fronten a Sektioune vum Lungegewebe.Titratioun gouf an Zellkulturen duerchgefouert andeems d'Zuel vu LacZ-positiven Zellen manuell zielt mat engem Hämozytometer fir den Titer an TU /ml ze berechnen.D'Träger gi bei -80 ° C cryopreservéiert, virum Gebrauch opgedaucht a mat CombiMag gebonnen andeems se 1: 1 vermëschen an op d'mannst 30 Minutte virun der Liwwerung op Äis inkubéieren.
Normal Sprague Dawley Ratten (n = 3 / Grupp, ~ 2-3 anästhetiséiert ip mat enger Mëschung aus 0.4mg / kg Medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) a 60mg / kg Ketamin (Ilium, Australien) am Alter vun 1 Mount) ip ) Injektioun an net-chirurgesch mëndlech Kannulatioun mat enger 16 Ga intravenöser Kanül.Fir sécherzestellen datt Tracheal Airway Tissue LV Transduktioun kritt, gouf et konditionéiert mat eisem virdru beschriwwene mechanesche Stéierungsprotokoll an deem d'Tracheal Airway Uewerfläch axial mat engem Drotkuerf reift (N-Circle, Nitinol Steen Extractor ouni Tipp NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Dann, ongeféier 10 Minutten no der Stéierung am Biosécherheetskabinett, gouf d'Trachealverwaltung vum LV-MP gemaach.
D'Magnéitfeld, dat an dësem Experiment benotzt gouf, war ähnlech wéi eng in vivo Röntgenstudie konfiguréiert, mat de selwechte Magnete iwwer d'Trachea mat Destillatiounsstentklammern (Dorënner 4).A 50 μl Volumen (2 x 25 μl aliquots) vun LV-MP war un der trachea geliwwert (n = 3 Déieren) mat engem gel-tippt Pipette wéi virdru beschriwwen.D'Kontrollgrupp (n = 3 Déieren) krut déi selwecht LV-MP ouni de Gebrauch vun engem Magnéit.Nom Ofschloss vun der Infusioun gëtt d'Kanule aus der endotrachealer Röhre ewechgeholl an d'Déier extubéiert.De Magnéit bleift 10 Minutten op der Plaz ier se ewechgeholl gëtt.Ratten goufen subcutaneously mat meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australien) gedoes, gefollegt vun Anästhesie Réckzuch duerch intraperitoneal Injektioun vun 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australien).Ratten goufen waarm gehal an observéiert bis komplett Erhuelung vun der Anästhesie.
LV-MP Liwwerung Apparat an engem biologesche Sécherheet Cabinet.Dir gesitt datt d'hellgrau Luer-Lock-Hülse vum ET-Röhre aus dem Mond erausstécht, an de Gel-Pipette-Spëtzt, deen an der Figur ugewise gëtt, gëtt duerch d'ET-Röhre op déi gewënscht Tiefe an d'Trachea agefouert.
Eng Woch no der LV-MP Administratiounsprozedur, goufen Déieren mënschlech geaffert duerch Inhalatioun vun 100% CO2 a LacZ Ausdrock gouf mat eiser Standard X-gal Behandlung bewäert.Déi dräi stäerkste caudal Knorpel Réng goufen geläscht ze garantéieren, datt all mechanesch Schued oder Flëssegket Retention wéinst endotracheal Rouer Placement net an der Analyse abegraff ginn.All Trachea gouf an der Längt geschnidden fir zwou Hälschent fir Analyse ze kréien an an enger Coupe mat Silikongummi (Sylgard, Dow Inc) gesat mat enger Minutien Nadel (Fine Science Tools) fir d'luminal Uewerfläch ze visualiséieren.D'Verdeelung an d'Charakter vun den transduced Zellen goufen duerch frontal Fotografie mat engem Nikon Mikroskop (SMZ1500) mat enger DigiLite Kamera an TCapture Software (Tucsen Photonics, China) bestätegt.D'Biller goufen op 20x Vergréisserung erfaasst (inklusiv de maximalen Astellung fir déi ganz Breet vun der Trachea), mat der ganzer Längt vun der Trachea Schrëtt fir Schrëtt ugewisen, genuch Iwwerlappung tëscht all Bild fir datt d'Biller "gestéckt" kënne ginn.D'Biller vun all Trachea goufen dann an engem eenzege Kompositbild kombinéiert mat Composite Image Editor Versioun 2.0.3 (Microsoft Research) mam Planar Motion Algorithmus. D'Gebitt vum LacZ Ausdrock bannent den Tracheal Komposit Biller vun all Déier gouf mat engem automatiséierte MATLAB Skript (R2020a, MathWorks) quantifizéiert wéi virdru beschriwwen28, mat Astellunge vun 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, a Value < 0.7. D'Gebitt vum LacZ Ausdrock bannent den Tracheal Komposit Biller vun all Déier gouf quantifizéiert mat engem automatiséierte MATLAB Skript (R2020a, MathWorks) wéi virdru beschriwwen28, mat Astellunge vun 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, a Value < 0.7. Плооаадэээээ Томатиззрованогогого я Начение <0 ,7. D'Gebitt vum LacZ Ausdrock a Komposit Tracheal Biller vun all Déier gouf mat engem automatiséierte MATLAB Skript (R2020a, MathWorks) quantifizéiert wéi virdru beschriwwen28 mat Astellunge vun 0,350,15 a Wäert <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复僐徺辌审复徺徺进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15和值< 0.7 的设置.如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气箄 嚄 箈 焏 礍 如 前所 述 , 自动 自动表达 量化, 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 。... Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определизов ованного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насьщенно, 0,0, 7> . Beräicher vum LacZ Ausdrock op Komposit Biller vun der Trachea vun all Déier goufen mat engem automatiséierte MATLAB Skript (R2020a, MathWorks) quantifizéiert wéi virdru beschriwwe mat Astellunge vun 0,35 < Hue < 0,58, Sättigung > 0,15 a Wäert < 0,7 .Andeems Dir Tissuekonturen am GIMP v2.10.24 verfollegt, gouf eng Mask manuell fir all Kompositbild erstallt fir d'Gewëssgebitt z'identifizéieren an eventuell falsch Detektiounen ausserhalb vum Trachealgewebe ze vermeiden.D'gefärbte Beräicher vun all Komposit Biller vun all Déier goufen zesummegefaasst der total gefierft Beräich fir dat Déier ze ginn.De gemoolt Gebitt gouf dann duerch d'Gesamtfläch vun der Mask gedeelt fir e normaliséierte Gebitt ze kréien.
All Trachea gouf a Paraffin agebonnen an 5 µm déck geschnidden.Sektioune goufen 5 Minutte mat neutralem séier rout counterstained a Biller goufen mat engem Nikon Eclipse E400 Mikroskop, DS-Fi3 Kamera an NIS Element Capture Software (Versioun 5.20.00) kaaft.
All statistesch Analysë goufen am GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) gemaach.Statistesch Bedeitung war op p ≤ 0,05 gesat.Normalitéit war mat der Shapiro-Wilk Test getest an Differenzen am LacZ staining sech mat engem unpaired T-Test bewäert.
Déi sechs Deputéierten, déi an Table 1 beschriwwe goufen, goufen duerch PCXI iwwerpréift, an d'Visibilitéit gëtt an Table 2 beschriwwen. Zwee Polystyrol-Deputéiert (MP1 an MP2; 18 μm respektiv 0,25 μm) waren net vun PCXI ze gesinn, awer déi verbleiwen Echantillon konnten identifizéiert ginn. (Beispiller ginn an der Figur 5 gewisen).MP3 an MP4 si schwaach sichtbar (10-15% Fe3O4; 0,25 µm respektiv 0,9 µm).Och wann MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) e puer vun de klengste Partikelen, déi getest goufen, enthält, war et am meeschte ausgeschwat.De CombiMag MP6 Produkt ass schwéier z'ënnerscheeden.An alle Fäll ass eis Fäegkeet fir MFs z'entdecken immens verbessert andeems de Magnéit parallel zur Kapillare hin an hier beweegt.Wéi d'Magnete sech vun der Kapillar ewech beweegen, goufen d'Partikelen a laange Ketten erausgezunn, awer wéi d'Magnete nokommen an d'Magnéitfeldstäerkt eropgeet, sinn d'Partikelkette verkierzt wéi d'Partikelen op d'Uewerfläch vun der Kapillär migréiert hunn (kuckt Supplemental Video S1 : MP4), d'Erhéijung vun der Partikeldicht op der Uewerfläch.Ëmgekéiert, wann de Magnéit aus der Kapillar geläscht gëtt, fällt d'Feldstäerkt erof an d'Deputéiert ëmarrangéieren sech a laang Ketten, déi vun der ieweschter Uewerfläch vun der Kapillar verlängeren (kuckt Supplementary Video S2: MP4).Nodeems de Magnéit ophält ze beweegen, beweegen d'Partikele weider fir eng Zäit nodeems se d'Gläichgewiichtspositioun erreecht hunn.Wéi den MP sech a Richtung an ewech vun der ieweschter Uewerfläch vun der Kapillar bewegt, tendéieren d'magnetesch Partikelen Dreck duerch d'Flëssegkeet ze zéien.
D'Visibilitéit vun MP ënner PCXI schwankt bedeitend tëscht Echantillon.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 an (d) MP6.All Biller hei gewisen goufen mat engem Magnéit geholl ongeféier 10 mm direkt iwwer d'Kapillar positionéiert.Déi anscheinend grouss Kreeser si Loftblasen, déi an de Kapillaren gefaange sinn, déi däitlech déi schwaarz-wäiss Randfeatures vum Phasekontrastbild weisen.Déi rout Këscht weist d'Vergréisserung un, déi de Kontrast verbessert.Bedenkt datt d'Duerchmiesser vun de Magnéitkreesser an all Figuren net op Skala sinn an ongeféier 100 Mol méi grouss sinn wéi gewisen.
Wéi de Magnéit lénks a riets laanscht d'Spëtzt vun der Kapillar bewegt, ännert de Wénkel vun der MP String fir mam Magnéit auszeleeën (kuckt Figur 6), sou datt d'Magnéitfeldlinnen ofgrenzt.Fir MP3-5, nodeems d'Akkord de Schwellwinkel erreecht huet, zéien d'Partikel laanscht d'Uewerfläch vun der Kapillar.Dëst resultéiert dacks datt Deputéierten a gréissere Gruppen clusteren no bei wou d'Magnéitfeld am stäerkste ass (kuckt Supplementary Video S3: MP5).Dëst ass och besonnesch evident wann Dir no beim Enn vun der Kapillar Bildbildung mécht, wat verursaacht datt den MP op der Flëssegkeet-Loft-Interface aggregéiert a konzentréiert.D'Partikelen am MP6, déi méi schwéier z'ënnerscheeden wéi déi am MP3-5, hunn net gezunn wann de Magnéit laanscht d'Kapillar bewegt ass, awer d'MP Saiten hunn sech dissoziéiert, d'Partikelen an der Sicht gelooss (kuckt Supplementary Video S4: MP6).An e puer Fäll, wann dat ugewandt Magnéitfeld reduzéiert gouf andeems de Magnéit eng laang Distanz vun der Imaging Site bewegt, sinn all verbleiwen Deputéierten duerch d'Schwéierkraaft lues op déi ënnescht Uewerfläch vum Röhre erofgaang, bleiwen am String (kuckt Supplementary Video S5: MP3) .
De Wénkel vun der MP String ännert sech wéi de Magnéit no riets iwwer d'Kapillar bewegt.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 an (d) MP6.Déi rout Këscht weist d'Vergréisserung un, déi de Kontrast verbessert.Notéiert w.e.g. datt déi zousätzlech Videoe fir Informatiounszwecker sinn, well se wichteg Partikelstruktur an dynamesch Informatioun opdecken, déi net an dëse statesche Biller visualiséiert kënne ginn.
Eis Tester hu gewisen datt d'Bewegung vum Magnéit lues a lues laanscht d'Trachea d'Visualiséierung vum MF am Kontext vun der komplexer Bewegung in vivo erliichtert.Keen in vivo Tester goufen duerchgefouert, well d'Polystyrolpärelen (MP1 an MP2) net an der Kapillare sichtbar waren.Jidderee vun de verbleiwen véier MFs gouf in vivo getest mat der laanger Achs vum Magnéit iwwer d'Trachea an engem Winkel vun ongeféier 30 ° zum Vertikal (kuckt d'Figuren 2b an 3a), well dëst zu méi laang MF Ketten gefouert huet a méi effektiv war wéi e Magnéit..Konfiguratioun ofgeschloss.MP3, MP4 an MP6 goufen net an der Trachea vu liewegen Déieren fonnt.Wann Dir den Atmungstrakt vu Ratten visualiséiert nodeems se d'Déieren humant ëmbruecht hunn, sinn d'Partikelen onsichtbar bliwwen, och wann zousätzlech Volumen mat enger Sprëtzpompel bäigefüügt gouf.MP5 hat den héchsten Eisenoxidgehalt a war déi eenzeg sichtbar Partikel, sou datt et benotzt gouf fir MP Verhalen in vivo ze evaluéieren an ze charakteriséieren.
D'Plazéierung vum Magnéit iwwer d'Trachea wärend der MF-Insertioun huet zu villen, awer net all, MFs am Gesiichtsfeld konzentréiert.Tracheal Entrée vu Partikel ass am beschten bei mënschlech euthaniséierter Déieren observéiert.Figur 7 an Ergänzungsvideo S6: MP5 weist séier magnetesch Erfaassung an Ausrichtung vu Partikelen op der Uewerfläch vun der ventrale Trachea, wat beweist datt Deputéiert op gewënschte Gebidder vun der Trachea gezielt kënne ginn.Wann Dir méi distal laanscht d'Trachea no der MF Liwwerung sicht, goufen e puer MFs méi no bei der Carina fonnt, wat net genuch Magnéitfeldstäerkt beweist fir all MFs ze sammelen an ze halen, well se duerch d'Regioun vun der maximaler Magnéitfeldstäerkt während der Flëssegverwaltung geliwwert goufen.Prozess.Wéi och ëmmer, postnatal MP Konzentratioune ware méi héich ronderëm d'Bildgebitt, wat suggeréiert datt vill Deputéierten an Airwayregiounen bliwwen sinn wou déi ugewandt Magnéitfeldstäerkt héchst war.
Biller vun (a) virun an (b) no der Liwwerung vum MP5 an der Trachea vun enger kierzlech euthaniséierter Rat mat engem Magnéit just iwwer dem Bildgebitt plazéiert.Dat ofgezeechent Gebitt läit tëscht zwee Knorpelréng.Et gëtt e bësse Flëssegkeet an den Atemwege virum MP geliwwert.Déi rout Këscht weist d'Vergréisserung un, déi de Kontrast verbessert.Dës Biller sinn aus dem Video geholl am S6: MP5 Supplementary Video.
D'Bewegung vum Magnéit laanscht d'Trachea in vivo huet zu enger Verännerung vum Wénkel vun der MP Kette op der Airway Uewerfläch gefouert, ähnlech wéi déi an de Kapillaren observéiert (kuckt Figur 8 an Ergänzungsvideo S7: MP5).Wéi och ëmmer, an eiser Etude konnten Deputéierten net laanscht d'Uewerfläch vu liewegen Atmungstrakt geschleeft ginn, sou wéi Kapillaren et kéinte maachen.A verschiddene Fäll verlängert d'MP Kette wéi de Magnéit lénks a riets bewegt.Interessanterweis hu mir och fonnt datt d'Partikelkette d'Tiefe vun der Uewerflächeschicht vun der Flëssegkeet ännert wann de Magnéit an der Längs laanscht d'Trachea bewegt gëtt, an erweidert wann de Magnéit direkt iwwer de Kapp bewegt gëtt an d'Partikelkette an eng vertikal Positioun rotéiert gëtt (kuckt Zousätzlech Video S7).: MP5 um 0:09, riets ënnen).D'charakteristesch Bewegungsmuster huet geännert wann de Magnéit lateral iwwer d'Spëtzt vun der Trachea bewegt gouf (dh lénks oder riets vum Déier, anstatt laanscht d'Längt vun der Trachea).D'Partikel waren nach ëmmer kloer ze gesinn während hirer Bewegung, awer wann de Magnéit aus der Trachea geläscht gouf, goufen d'Spëtze vun de Partikelstringen sichtbar (kuckt Supplementary Video S8: MP5, ab 0:08).Dëst entsprécht dem observéierte Verhalen vum Magnéitfeld ënner der Handlung vun engem applizéierte Magnéitfeld an enger Glaskapillar.
Probe Biller déi MP5 an der Trachea vun enger liewegen anästhetiséierter Rat weisen.(a) De Magnéit gëtt benotzt fir Biller uewen a lénks vun der Trachea ze kréien, dann (b) nodeems de Magnéit no riets bewegt ass.Déi rout Këscht weist d'Vergréisserung un, déi de Kontrast verbessert.Dës Biller sinn aus dem Video am S7's Supplementary Video gewisen: MP5.
Wann déi zwee Pole an enger Nord-Süd Orientéierung iwwer an ënner der Trachea ofgestëmmt goufen (dh unzezéien; Fig. 3b), sinn d'MP Akkorde méi laang erschéngen a waren op der Säitwand vun der Trachea anstatt op der dorsaler Uewerfläch vun der Trachea. trachea (kuckt Anhang).Video S9:MP5).Wéi och ëmmer, héich Konzentratioune vu Partikelen op enger Plaz (dh d'dorsal Uewerfläch vun der Trachea) goufen net no der Flëssegverwaltung mat engem Dual Magnéitapparat festgestallt, wat normalerweis mat engem eenzege Magnéitapparat geschitt.Dann, wann ee Magnéit konfiguréiert war fir Géigepole ze repetéieren (Figur 3c), ass d'Zuel vun de Partikelen, déi am Siichtfeld siichtbar sinn, no der Liwwerung net eropgaang.Béid zwou Magnéitkonfiguratiounen opzestellen ass Erausfuerderung wéinst der héijer Magnéitfeldstäerkt déi d'Magnete respektiv unzitt oder dréckt.De Setup gouf dunn zu engem eenzege Magnéit parallel zu den Airways geännert, awer duerch d'Atemweeër an engem 90-Grad-Wénkel passéiert, sou datt d'Kraaftlinnen d'Trachealmauer orthogonal gekräizt hunn (Figure 3d), eng Orientéierung geduecht fir d'Méiglechkeet vu Partikelaggregatioun op ze bestëmmen. der Säit Mauer.observéiert ginn.Wéi och ëmmer, an dëser Konfiguratioun gouf et keng erkennbar MF Akkumulationsbewegung oder Magnéitbewegung.Baséierend op all dës Resultater, gouf eng Konfiguratioun mat engem eenzege Magnéit an enger 30-Grad Orientéierung fir VIVO Studien vu Genträger gewielt (Fig. 3a).
Wann d'Déier e puer Mol direkt no der Mënschheet geaffert gouf, huet d'Feele vun enger interferéierender Tissuebewegung bedeit datt méi fein, méi kuerz Partikellinnen am kloren intercartilaginöse Feld z'erkennen, 'schwingend' am Aklang mat der Iwwersetzungsbewegung vum Magnéit.kloer d'Präsenz an d'Bewegung vun MP6 Partikel gesinn.
Den Titer vum LV-LacZ war 1,8 x 108 IU/ml, an nom Vermëschung 1:1 mat CombiMag MP (MP6), goufen Déieren mat 50 μl vun enger Tracheal Dosis vun 9 x 107 IU/ml vum LV Gefier (dh 4,5) injizéiert. x 106 TU/rat).).).An dësen Studien, anstatt de Magnéit während der Aarbecht ze beweegen, hu mir de Magnéit an enger Positioun fixéiert fir ze bestëmmen ob d'LV-Transduktioun (a) am Verglach mat der Vektorliwwerung an der Verontreiung vun engem Magnéitfeld verbessert ka ginn, an (b) wann d'Atemwee kéint fokusséiert sinn.D'Zellen ginn an de magnetesche Zilgebidder vum ieweschten Atmungstrakt transducéiert.
D'Präsenz vu Magnete an d'Benotzung vu CombiMag a Kombinatioun mat LV Vecteure schéngen net negativ op Déieregesondheet ze beaflossen, sou wéi eise Standard LV Vecteure Liwwerprotokoll.Frontal Biller vun der tracheal Regioun ënner mechanesche Stéierungen (Ergänzlech Fig. 1) weisen datt d'LV-MP behandelt Grupp wesentlech méi héich Transduktiounsniveauen an der Präsenz vun engem Magnéit haten (Fig. 9a).Nëmmen eng kleng Quantitéit vun blo LacZ staining war präsent an der Kontroll Grupp (Dorënner 9b).Quantifikatioun vun X-Gal-gefiermt normalized Regiounen gewisen, datt Administratioun vun LV-MP an der Presenz vun engem Magnéitfeld zu enger ongeféier 6-fantastesch Verbesserung (Lalumi 9c) gefouert.
Beispill vu Komposit Biller déi Tracheal Transduktioun mat LV-MP weisen (a) an der Präsenz vun engem Magnéitfeld an (b) an der Verontreiung vun engem Magnéit.(c) Statistesch bedeitend Verbesserung am normaliséierte Gebitt vun der LacZ Transduktioun an der Trachea mat der Verwäertung vun engem Magnéit (*p = 0,029, t-Test, n = 3 pro Grupp, mëttler ± Standardfehler vum mëttleren).
Neutral séier rout-gefierft Rubriken (Beispill an Zousaz Lalumi gewisen. 2) uginn, datt LacZ-Kierper Zellen an der selwechter Prouf präsent waren an an der selwechter Plaz wéi virdrun gemellt.
D'Schlëssel Erausfuerderung an der Airway Gentherapie bleift déi präzis Lokalisatioun vun Trägerpartikelen an Interesseberäicher an d'Erreeche vun engem héijen Niveau vun der Transduktiounseffizienz an der mobiler Lunge an der Präsenz vum Loftfloss an der aktiver Schleimkloerung.Fir LV Träger geduecht fir d'Behandlung vun Atmungskrankheeten an der zystesch Fibrose, d'Erhéijung vun der Openthaltszäit vun den Trägerpartikelen an de konduktiven Atemwege war bis elo en onerreechbar Zil.Wéi vun Castellani et al. uginn, huet d'Benotzung vu magnetesche Felder fir d'Transduktioun ze verbesseren Virdeeler iwwer aner Genliwwerungsmethoden wéi Elektroporatioun, well et Einfachheet, Wirtschaft, lokaliséiert Liwwerung, erhéicht Effizienz a méi kuerzer Inkubatiounszäit kombinéiere kann.a méiglecherweis eng méi niddreg Dosis Gefier10.Wéi och ëmmer, in vivo Oflagerung a Verhalen vu magnetesche Partikelen an den Atemwege ënner dem Afloss vun externe magnetesche Kräfte gouf ni beschriwwen, an tatsächlech ass d'Fäegkeet vun dëser Methode fir d'Genexpressiounsniveauen an intakt liewegen Atemwege ze erhéijen net in vivo bewisen.
Eis In vitro Experimenter op der PCXI Synchrotron weisen datt all d'Partikel déi mir getest hunn, mat Ausnam vum MP Polystyrol, siichtbar waren an der Bildopstellung déi mir benotzt hunn.An der Präsenz vun engem Magnéitfeld bilden d'Magnéitfelder Saiten, d'Längt vun deenen ass mat der Aart vun de Partikelen an der Stäerkt vum Magnéitfeld (dh d'Proximitéit an d'Bewegung vum Magnéit) verbonnen.Wéi an der Figur 10 gewisen, ginn d'Strings, déi mir beobachten, geformt wéi all eenzel Partikel magnetiséiert gëtt an säin eegent lokalt Magnéitfeld induzéiert.Dës getrennte Felder verursaachen aner ähnlech Partikelen ze sammelen a mat Gruppestringbewegungen ze verbannen wéinst lokalen Kräfte vun de lokale Kräfte vun Attraktioun an Oflehnung vun anere Partikelen.
Diagramm weist (a, b) Ketten vu Partikelen, déi sech an flëssege gefëllte Kapillaren bilden an (c, d) eng Loftgefëllte Trachea.Bedenkt datt d'Kapillaren an d'Trachea net op Skala gezeechent ginn.Panel (a) enthält och eng Beschreiwung vum MF mat Fe3O4 Partikelen a Ketten arrangéiert.
Wann de Magnéit iwwer d'Kapillar bewegt ass, huet de Wénkel vun der Partikelstreng de kritesche Schwell fir MP3-5 mat Fe3O4 erreecht, duerno ass d'Partikelstreng net méi a senger ursprénglecher Positioun bliwwen, mee laanscht d'Uewerfläch op eng nei Positioun geplënnert.Magnéit.Dësen Effekt geschitt méiglecherweis well d'Uewerfläch vun der Glaskapillar glat genuch ass fir dës Bewegung z'erméiglechen.Interessanterweis huet MP6 (CombiMag) sech net esou behuelen, vläicht well d'Partikele méi kleng waren, eng aner Beschichtung oder Uewerflächeladung haten, oder déi propriétaire Carrier Flëssegkeet hir Fäegkeet beaflosst ze bewegen.De Kontrast am CombiMag Partikelbild ass och méi schwaach, wat suggeréiert datt d'Flëssegkeet an d'Partikelen déiselwecht Dicht hunn an dofir net einfach openee kënnen bewegen.Partikel kënnen och hänke bleiwen wann de Magnéit ze séier bewegt, wat beweist datt d'Magnéitfeldstäerkt net ëmmer d'Reibung tëscht Partikelen an der Flëssegkeet iwwerwanne kann, wat suggeréiert datt d'Magnéitfeldkraaft an d'Distanz tëscht dem Magnéit an dem Zilgebitt net als eng Iwwerraschung.wichteg.Dës Resultater weisen och un datt obwuel Magnete vill Mikropartikelen erfaasse kënnen, déi duerch d'Zilgebitt fléissen, et ass onwahrscheinlech datt Magnete kënne vertrauen fir CombiMag Partikelen laanscht d'Uewerfläch vun der Trachea ze bewegen.Also hu mir ofgeschloss datt in vivo LV MF Studien statesch Magnéitfelder benotze fir kierperlech spezifesch Gebidder vum Airway Bam ze zielen.
Wann d'Partikelen an de Kierper geliwwert ginn, si si schwéier ze identifizéieren am Kontext vum komplexe bewegende Tissue vum Kierper, awer hir Detektiounsfäegkeet gouf verbessert andeems de Magnéit horizontal iwwer d'Trachea beweegt fir d'MP Saiten ze "wiggelen".Wärend Echtzäit Imaging méiglech ass, ass et méi einfach d'Partikelbewegung z'erkennen nodeems d'Déier mënschlech ëmbruecht gouf.MP Konzentratioune waren normalerweis héchsten op dëser Plaz wann de Magnéit iwwer d'Bildgebitt positionéiert war, obwuel e puer Partikelen normalerweis méi wäit an der Trachea fonnt goufen.Am Géigesaz zu In vitro Studien kënnen d'Partikelen net duerch d'Bewegung vun engem Magnéit an d'Trachea erofgezunn ginn.Dës Entdeckung ass konsequent mat wéi de Schleim, deen d'Uewerfläch vun der Trachea iwwerdeckt, typesch inhaléiert Partikel veraarbecht, se an de Schleim fangen an duerno duerch de Schleim-ciliary Clearance-Mechanismus läscht.
Mir hunn hypothetiséiert datt d'Benotzung vu Magnete iwwer an ënner der Trachea fir Attraktioun (Fig. 3b) zu engem méi eenheetleche Magnéitfeld resultéiere kéint, anstatt e Magnéitfeld dat op engem Punkt héich konzentréiert ass, wat potenziell zu enger méi eenheetlecher Verdeelung vu Partikelen resultéiert..Wéi och ëmmer, eis virleefeg Studie huet keng kloer Beweiser fonnt fir dës Hypothese z'ënnerstëtzen.Ähnlech, e Paart vu Magnete setzen fir ze repulséieren (Fig. 3c) huet net zu méi Partikelen sech am Bildgebitt gesat.Dës zwee Entdeckunge weisen datt den Dual-Magnéit-Setup d'lokal Kontroll vum MP Pointing net wesentlech verbessert, an datt déi resultéierend staark magnetesch Kräfte schwéier ze stëmmen, wat dës Approche manner praktesch mécht.Ähnlech huet d'Orientéierung vum Magnéit iwwer an iwwer d'Trachea (Figure 3d) och d'Zuel vun de Partikelen, déi am Bildgebitt bleiwen, net erhéicht.E puer vun dësen alternativen Konfiguratiounen kënnen net erfollegräich sinn, well se zu enger Reduktioun vun der Magnéitfeldstäerkt an der Oflagerungszone féieren.Sou gëtt déi eenzeg Magnéit Konfiguratioun op 30 Grad (Fig. 3a) als déi einfachst an effizientst in vivo Testmethod ugesinn.
D'LV-MP Studie huet gewisen datt wann LV Vecteure mat CombiMag kombinéiert goufen a geliwwert goufen nodeems se physesch gestéiert goufen an der Präsenz vun engem Magnéitfeld, d'Transduktiounsniveauen an der Trachea wesentlech eropgaange sinn am Verglach mat Kontrollen.Baséierend op Synchrotron Imaging Studien a LacZ Resultater, schéngt d'Magnéitfeld de LV an der Trachea ze halen an d'Zuel vu Vektorpartikelen ze reduzéieren, déi direkt déif an d'Lunge penetréiert hunn.Esou Zilverbesserunge kënnen zu méi héijer Effizienz féieren, wärend geliwwert Titer, net geziilt Transduktioun, entzündlech an immun Nebenwirkungen, a Gentransferkäschte reduzéiert ginn.Wichteg ass, laut dem Hiersteller, CombiMag kann a Kombinatioun mat anere Gentransfermethoden benotzt ginn, dorënner aner virale Vektoren (wéi AAV) an Nukleinsäuren.